| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 文献综述 | 第10-25页 |
| 1.1 细胞内Ca~(2+)信号转导 | 第10页 |
| 1.1.1 细胞信号转导 | 第10页 |
| 1.1.2 细胞内Ca~(2+)的信号转导 | 第10页 |
| 1.2 Ca~(2+)释放激活Ca~(2+)通道（CRAC）及其特性 | 第10-24页 |
| 1.2.1 CRAC通道 | 第10-11页 |
| 1.2.2 Orai结构与功能 | 第11-16页 |
| 1.2.2.1 Orai蛋白的结构 | 第11-13页 |
| 1.2.2.2 Orai通道的门控 | 第13-14页 |
| 1.2.2.3 Orai通道的失活 | 第14-16页 |
| 1.2.3 STIM结构与功能 | 第16-21页 |
| 1.2.3.1 STIM蛋白的结构 | 第16-17页 |
| 1.2.3.2 STIM蛋白的功能 | 第17-21页 |
| 1.2.4 CRAC通道激活的分子机制及研究进展 | 第21-24页 |
| 1.3 论文的研究目标和意义 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-33页 |
| 2.1.1 目的基因 | 第25页 |
| 2.1.2 质粒 | 第25-27页 |
| 2.1.2.1 本研究所用质粒 | 第25-26页 |
| 2.1.2.2 本研究中所构建的质粒 | 第26-27页 |
| 2.1.3 用于扩增和表达的大肠杆菌和酵母菌株 | 第27-28页 |
| 2.1.4 常用试剂和溶液的配制 | 第28-31页 |
| 2.1.5 实验主要仪器 | 第31-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-52页 |
| 2.2.1 基因克隆 | 第33-37页 |
| 2.2.1.1 引物设计与合成 | 第33页 |
| 2.2.1.2 目的基因的扩增 | 第33-35页 |
| 2.2.1.3 PCR产物的电泳鉴定及回收 | 第35页 |
| 2.2.1.4 DNA片段和载体的双酶切 | 第35-36页 |
| 2.2.1.5 DNA目的片段和载体的连接与转化 | 第36页 |
| 2.2.1.6 重组质粒的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.2 细胞培养、转染和荧光成像 | 第37-38页 |
| 2.2.2.1 细胞培养 | 第37页 |
| 2.2.2.2 转染 | 第37-38页 |
| 2.2.2.3 荧光成像 | 第38页 |
| 2.2.3 电生理（膜片钳技术） | 第38-39页 |
| 2.2.4 目的蛋白E.coli表达系统的表达与纯化（STIM蛋白） | 第39-43页 |
| 2.2.4.1 目的蛋白E.coli表达系统的小量表达 | 第39页 |
| 2.2.4.2 目的蛋白E.coli表达系统的大量表达 | 第39-43页 |
| 2.2.5 目的蛋白Pichia pastoris表达系统的表达与纯化（dOrai膜蛋白） | 第43-50页 |
| 2.2.5.1 大量线性化载体制备 | 第43-44页 |
| 2.2.5.2 感受态细胞的制备及酵母细胞电转化 | 第44-46页 |
| 2.2.5.3 酵母表达系统的试表达 | 第46-47页 |
| 2.2.5.4 目标蛋白的大规模表达与纯化 | 第47-50页 |
| 2.2.6 等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） | 第50-52页 |
| 2.2.6.1 ITC作用原理 | 第50-51页 |
| 2.2.6.2 ITC样品准备 | 第51-52页 |
| 3 利用Pichia pastoris过表达和分离纯化果蝇来源的膜蛋白dOrai | 第52-57页 |
| 3.1 酵母阳性克隆的筛选 | 第52-55页 |
| 3.1.1 pPICZ A-Dr-Orai质粒的构建和提取 | 第52-53页 |
| 3.1.2 pPICZ A-Dr-Orai酵母阳性克隆表达筛选 | 第53-55页 |
| 3.1.2.1 pPICZ A-Dr-Orai酵母阳性克隆表达筛选原理及流程 | 第53页 |
| 3.2.1.2 pPICZ A-Dr-Orai酵母阳性克隆筛选结果 | 第53-55页 |
| 3.2 dOrai膜蛋白的大规模表达与分离纯化 | 第55-57页 |
| 4 利用大肠杆菌过表达和分离纯化果蝇来源的STIM蛋白 | 第57-64页 |
| 4.1 分子克隆 | 第57页 |
| 4.2 果蝇源STIM蛋白的表达与纯化 | 第57-61页 |
| 4.2.1 果蝇源STIM蛋白的试表达 | 第57-58页 |
| 4.2.2 果蝇源STIM蛋白的大量表达 | 第58-60页 |
| 4.2.3 果蝇源STIM蛋白的大量表达条件优化 | 第60-61页 |
| 4.3 果蝇源STIM蛋白的功能测定 | 第61-64页 |
| 4.3.1 质粒构建和细胞转染 | 第61-62页 |
| 4.3.2 果蝇源STIM蛋白的荧光成像 | 第62-63页 |
| 4.3.3 电生理 | 第63-64页 |
| 5 ITC相互作用分析 | 第64-66页 |
| 5.1 Dr-Orai蛋白与Dr-S403-555 蛋白ITC相互作用 | 第64-65页 |
| 5.2 Dr-Orai蛋白与Dr-S374-555 蛋白ITC相互作用 | 第65-66页 |
| 6 讨论与展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-83页 |
| 致谢 | 第83-85页 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第85页 |
