| 中文摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1. 文献综述 | 第12-23页 |
| 1.1 寄生线虫病现状 | 第12页 |
| 1.2 蛋白激酶的药物开发历史 | 第12-13页 |
| 1.3 非典型蛋白激酶 | 第13-14页 |
| 1.4 核糖体亚基的加工过程 | 第14-16页 |
| 1.5 RIO蛋白激酶在秀丽新杆线虫中的功能研究 | 第16-17页 |
| 1.6 RIO蛋白激酶在寄生线虫中的研究现状 | 第17页 |
| 1.7 粪类圆线虫简介 | 第17-19页 |
| 1.7.1 粪类圆线虫的生活史和流行概况 | 第17-18页 |
| 1.7.2 类圆线虫病 | 第18-19页 |
| 1.8 寄生线虫基因功能研究方法 | 第19-23页 |
| 1.8.1 RNAi在寄生虫中的应用 | 第19-20页 |
| 1.8.2 寄生线虫转基因技术 | 第20-21页 |
| 1.8.3 粪类圆线虫的转基因研究进展 | 第21-23页 |
| 2. 研究目的与意义 | 第23-24页 |
| 3. 实验材料与研究方法 | 第24-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 3.1.1 实验动物及试验用菌株、载体 | 第24页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第24页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第24-25页 |
| 3.2 试验溶液的制备 | 第25-26页 |
| 3.2.1 抗生素，培养基的制备 | 第25页 |
| 3.2.2 碱裂解法质粒抽提主要溶液及核酸实验主要试剂 | 第25页 |
| 3.2.3 蛋白实验主要试剂的配置 | 第25-26页 |
| 3.2.4 线虫收集用缓冲液 | 第26页 |
| 3.3 实验方法 | 第26-50页 |
| 3.3.1 实验动物感染模型的建立及虫体的收集 | 第26-27页 |
| 3.3.2 RNA的提取 | 第27-28页 |
| 3.3.3 DNA的提取及Genome-walker文库的构建 | 第28-29页 |
| 3.3.3.1 gDNA的提取 | 第28-29页 |
| 3.3.3.2 Genome-walker文库的构建 | 第29页 |
| 3.3.4 粪类圆线虫 18S gRNA部分序列的扩增及测序 | 第29-32页 |
| 3.3.4.118S gDNA的扩增 | 第29-30页 |
| 3.3.4.2 PCR产物的凝胶检测 | 第30页 |
| 3.3.4.3 PCR产物的纯化回收 | 第30-31页 |
| 3.3.4.4 目的片段的连接 | 第31页 |
| 3.3.4.5 大肠杆菌感受态的制备及连接产物的转化 | 第31页 |
| 3.3.4.6 菌液PCR的鉴定 | 第31-32页 |
| 3.3.5 粪类圆线虫Ss-riok-1 基因的分离鉴定 | 第32-33页 |
| 3.3.5.1 Ss-riok-1 EST的扩增及测序 | 第32-33页 |
| 3.3.6 基因编码区序列的获得 | 第33-38页 |
| 3.3.6.1 Ss-riok-1 全长cDNA的获得 | 第33-36页 |
| 3.3.6.2 Ss-riok-1 基因编码区的突变 | 第36-37页 |
| 3.3.6.3 Ss-lin-35，Ss-kin-3，Ss-nob1，Ss-pno1 基因编码区的获得 | 第37-38页 |
| 3.3.7 Ss-riok-1 基因组序列的扩增及转录调控区域的扩增 | 第38-40页 |
| 3.3.7.1 Ss-riok-1 gDNA序列的扩增 | 第38页 |
| 3.3.7.2 转录调控区序列的获得 | 第38-40页 |
| 3.3.8 生物信息学分析 | 第40-41页 |
| 3.3.9 质粒的构建 | 第41-44页 |
| 3.3.9.1 原核表达质粒的构建 | 第41-42页 |
| 3.3.9.2 转基因质粒的构建 | 第42-43页 |
| 3.3.9.3 酵母双杂交系统质粒的构建 | 第43-44页 |
| 3.3.10 Ss-riok-1 的原核表达以及纯化 | 第44-45页 |
| 3.3.10.1 小量表达 | 第44页 |
| 3.3.10.2 大量表达及纯化 | 第44-45页 |
| 3.3.10.3 重组蛋白的Westernblot检测 | 第45页 |
| 3.3.11 激酶活性的检测 | 第45-46页 |
| 3.3.12 粪类圆线虫的显微注射操作 | 第46-48页 |
| 3.3.12.1 显微注射的准备工作 | 第46页 |
| 3.3.12.2 显微注射 | 第46-47页 |
| 3.3.12.3 幼虫的观察 | 第47页 |
| 3.3.12.4 孵化率的计算 | 第47页 |
| 3.3.12.5 幼虫发育缺陷的评价 | 第47页 |
| 3.3.12.6 Single-worm RT-PCR以及蛋白质的提取 | 第47-48页 |
| 3.3.13 利用酵母双杂交系统验证蛋白的相互作用 | 第48-50页 |
| 3.3.13.1 酵母感受态的制备 | 第48-49页 |
| 3.3.13.2 酵母转化 | 第49页 |
| 3.3.13.3 蛋白互作检测 | 第49-50页 |
| 4. 结果和分析 | 第50-77页 |
| 4.1 粪类圆线虫Ss-riok-1 基因的cDNA序列的获得 | 第50-53页 |
| 4.2 Ss-riok-1 的基因组结构 | 第53-54页 |
| 4.3 重组Ss-RIOK-1 的蛋白表达和激酶活性检测 | 第54-56页 |
| 4.4 Ss-riok-1 的转录水平分析 | 第56-57页 |
| 4.5 Ss-riok-1 的转录调控区的获得和分析 | 第57-60页 |
| 4.5.1 基因组的提取以及Genome-walker PCR | 第57页 |
| 4.5.2 转录调控区序列的扩增和分析 | 第57-60页 |
| 4.6 Ss-riok-1 的组织表达谱 | 第60-63页 |
| 4.7 Ss-RIOK-1 突变型的体外激酶活性检测 | 第63-64页 |
| 4.8 Ss-RIOK-1 野生型和突变型的体内表达检测 | 第64-69页 |
| 4.9 Ss-RIOK-1（D282A）突变型对幼虫发育的影响 | 第69-72页 |
| 4.9.1 Ss-RIOK-1 突变型降低了虫卵的孵化率 | 第69-70页 |
| 4.9.2 Ss-RIOK-1 突变型降低了PFL L2 的运动性 | 第70-71页 |
| 4.9.3 Ss-RIOK-1 突变型的体内过表达造成了PFL L2 到iL3 的发育缺陷 | 第71-72页 |
| 4.10 Ss-RIOK-1 互作蛋白的初步验证和研究 | 第72-77页 |
| 4.10.1 Ss-lin-35，Ss-kin-3，Ss-riok-2，Ss-nob1，Ss-pno1 基因的扩增 | 第72-73页 |
| 4.10.2 Ss-riok-1 与Ss-lin-35，Ss-kin-3，Ss-riok-2 基因在酵母细胞的表达检测 62 4.10.3 Ss-RIOK-1 与预测互作蛋白在酵母细胞中的互作检测 | 第73-74页 |
| 4.10.3 Ss-RIOK-1 与预测互作蛋白在酵母细胞中的互作检测 | 第74-77页 |
| 5. 讨论 | 第77-87页 |
| 5.1 Ss-RIOK-1 具有RIOK-1 激酶的序列特征 | 第77-78页 |
| 5.2 Ss-RIOK-1 是一个具有活性的激酶，且激酶活性依赖催化位点的天冬氨酸 | 第78-79页 |
| 5.3 Ss-riok-1 基因组结构和转录调控区域分析 | 第79-80页 |
| 5.4 Ss-riok-1 的时空表达特征 | 第80-82页 |
| 5.5 体内过表达Ss-RIOK-1 突变激酶对幼虫发育的影响 | 第82-84页 |
| 5.5.1 Ss-RIOK-1 在胞质中发挥作用 | 第82-83页 |
| 5.5.2 突变的Ss-RIOK-1 引起了幼虫发育的缺陷 | 第83-84页 |
| 5.6 Ss-RIOK-1 可能的作用机制 | 第84-87页 |
| 6. 结论 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-100页 |
| 致谢 | 第100-102页 |
| 附录 1 | 第102-109页 |
| 附录 2 | 第109-110页 |
