| 摘要 | 第9-14页 |
| ABSTRACT | 第14-19页 |
| 缩写词表 | 第20-21页 |
| 第一章 前言 | 第21-55页 |
| 1.1 糖生物学概述 | 第21-25页 |
| 1.1.1 糖生物学 | 第21页 |
| 1.1.2 糖链的结构解析和糖链合成 | 第21-25页 |
| 1.2 糖苷酶及其在糖类合成中的应用 | 第25-34页 |
| 1.2.1 糖苷酶的作用机制 | 第25-27页 |
| 1.2.2 糖苷酶在糖类合成中的应用 | 第27-28页 |
| 1.2.3 糖苷酶的分子改造 | 第28-34页 |
| 1.3 α-半乳糖苷酶的研究进展 | 第34-47页 |
| 1.3.1 α-半乳糖苷酶的分类 | 第35-36页 |
| 1.3.2 α-半乳糖苷酶应用 | 第36-42页 |
| 1.3.3 α-半乳糖苷酶分子改造研究进展 | 第42-44页 |
| 1.3.4 α-半乳糖苷酶晶体结构研究进展 | 第44-47页 |
| 1.4 蛋白质晶体学 | 第47-53页 |
| 1.4.1 蛋白质晶体生长的原理 | 第48页 |
| 1.4.2 蛋白质晶体生长条件的方法 | 第48-49页 |
| 1.4.3 蛋白质晶体生长条件的筛选 | 第49页 |
| 1.4.4 提高蛋白质晶体质量的策略 | 第49-53页 |
| 1.5 本论文的工作基础、研究内容及意义 | 第53-55页 |
| 1.5.1 工作基础 | 第53-54页 |
| 1.5.2 本论文研究内容及意义 | 第54-55页 |
| 第二章 转糖基α-半乳糖苷酶Aga2的分子改造 | 第55-76页 |
| 2.1 材料和方法 | 第55-63页 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 | 第55-56页 |
| 2.1.2 菌株和质粒 | 第56页 |
| 2.1.3 培养基和培养条件 | 第56-57页 |
| 2.1.4 DNA操作技术 | 第57-60页 |
| 2.1.5 重组蛋白的IPTG诱导表达 | 第60页 |
| 2.1.6 α-半乳糖苷酶水解活力测定 | 第60页 |
| 2.1.7 高效突变酶的筛选 | 第60-61页 |
| 2.1.8 TLC层析 | 第61页 |
| 2.1.9 HPLC层析 | 第61页 |
| 2.1.10 镍亲和层析分离提纯His-tag突变酶 | 第61-62页 |
| 2.1.11 蛋白质含量测定 | 第62页 |
| 2.1.12 蛋白质电泳技术 | 第62页 |
| 2.1.13 突变酶动力学参数测定 | 第62-63页 |
| 2.1.14 Aga2及其突变酶的同源模建 | 第63页 |
| 2.2 结果 | 第63-72页 |
| 2.2.1 Aga2的随机突变及高效转苷酶的筛选 | 第63-65页 |
| 2.2.2 Aga2的定点突变及高效转苷酶的筛选 | 第65-67页 |
| 2.2.3 高效突变酶的大量表达和纯化 | 第67页 |
| 2.2.4 高效突变酶的动力学分析 | 第67-68页 |
| 2.2.5 高效突变酶的突变氨基酸位点分析 | 第68-72页 |
| 2.3 讨论 | 第72-75页 |
| 本章小结 | 第75-76页 |
| 第三章 转糖基α-半乳糖苷酶Aga2突变酶合成药用寡糖globotriose衍生物的研究 | 第76-95页 |
| 3.1 材料和方法 | 第76-79页 |
| 3.1.1 主要试剂和仪器 | 第76页 |
| 3.1.2 菌株和质粒 | 第76-77页 |
| 3.1.3 培养基和培养条件 | 第77页 |
| 3.1.4 蛋白质操作技术 | 第77页 |
| 3.1.5 重组原始酶Aga2和突变酶以乳糖和甲基乳糖为受体的转糖基反应 | 第77页 |
| 3.1.6 离子色谱(HPAEC)分析方法 | 第77页 |
| 3.1.7 突变酶V564N以甲基乳糖为受体的转糖基反应的条件优化 | 第77-78页 |
| 3.1.8 转糖基产物的分离纯化 | 第78-79页 |
| 3.1.9 转糖基产物的结构鉴定 | 第79页 |
| 3.2 结果 | 第79-92页 |
| 3.2.1 原始重组酶Aga2和突变酶以乳糖为受体的转糖基反应 | 第80页 |
| 3.2.2 以乳糖为受体的转糖基产物的离子色谱(HPAEC)分析 | 第80-81页 |
| 3.2.3 以乳糖为受体的转糖基产物的纯化和结构鉴定 | 第81-85页 |
| 3.2.4 原始重组酶Aga2和突变酶以甲基乳糖为受体的转糖基反应 | 第85-87页 |
| 3.2.5 突变酶V564N以甲基乳糖为受体合成转糖基产物的条件优化 | 第87-88页 |
| 3.2.9 以甲基乳糖为受体的转糖基产物的纯化 | 第88-89页 |
| 3.2.10 以甲基乳糖为受体的转糖基产物的结构鉴定 | 第89-92页 |
| 3.3 讨论 | 第92-93页 |
| 本章小结 | 第93-95页 |
| 第四章 转糖基α-半乳糖苷酶区域选择性的研究 | 第95-118页 |
| 4.1 材料和方法 | 第95-96页 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 | 第95页 |
| 4.1.2 突变酶V564N以葡二糖为受体的转糖基反应 | 第95页 |
| 4.1.3 转糖基产物的分离纯化 | 第95-96页 |
| 4.1.4 转糖基产物的结构鉴定 | 第96页 |
| 4.2 结果和讨论 | 第96-116页 |
| 4.2.1 突变酶V564N以葡二糖为受体的转糖基区域选择性研究 | 第96-115页 |
| 4.2.2 讨论 | 第115-116页 |
| 本章小结 | 第116-118页 |
| 第五章 转糖基α-半乳糖苷酶Aga2的蛋白质晶体生长研究 | 第118-134页 |
| 5.1 材料和方法 | 第118-123页 |
| 5.1.1 主要试剂和仪器 | 第118-119页 |
| 5.1.2 菌株和质粒 | 第119页 |
| 5.1.3 培养基和培养条件 | 第119-120页 |
| 5.1.4 蛋白质操作技术 | 第120页 |
| 5.1.5 原始重组Aga2和硒代重组Aga2的纯化 | 第120-121页 |
| 5.1.6 硒代重组Aga2的硒代替换率计算 | 第121页 |
| 5.1.7 原始重组Aga2蛋白质结晶条件的普筛 | 第121-122页 |
| 5.1.8 原始重组Aga2结晶条件的优化 | 第122-123页 |
| 5.1.9 硒代重组Aga2的蛋白质结晶 | 第123页 |
| 5.2 结果 | 第123-131页 |
| 5.2.1 原始重组Aga2的纯化 | 第123-125页 |
| 5.2.2 原始重组Aga2蛋白质晶体的生长及优化 | 第125-128页 |
| 5.2.3 硒代重组Aga2的纯化 | 第128-129页 |
| 5.2.4 硒代重组Aga2的硒代率 | 第129-130页 |
| 5.2.5 硒代重组Aga2蛋白质晶体的生长及优化 | 第130-131页 |
| 5.3 讨论 | 第131-133页 |
| 本章小结 | 第133-134页 |
| 全文总结 | 第134-135页 |
| 附录 | 第135-173页 |
| 1 以乳糖和甲基乳糖为受体的转糖基产物的核磁共振图谱 | 第135-147页 |
| 2 以葡二糖为受体的转糖基产物的质谱和核磁共振图谱 | 第147-173页 |
| 参考文献 | 第173-184页 |
| 论文发表与专利申请 | 第184-185页 |
| 致谢 | 第185-186页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第186页 |
