| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略语 | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-22页 |
| 1 引言 | 第14-19页 |
| 1.1 异柠檬酸脱氢酶的概述 | 第14-16页 |
| 1.2 IDH2突变的发现 | 第16页 |
| 1.3 IDH突变的生物学功能 | 第16-18页 |
| 1.4 抑制剂Bortezomib与 17-AAG | 第18-19页 |
| 2 前期研究结果 | 第19页 |
| 3 实验目的与意义 | 第19-20页 |
| 4 实验内容及设计方案 | 第20-22页 |
| 4.1 本课题研究内容 | 第20-21页 |
| 4.2 技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 IDH2真核表达载体的构建 | 第22-34页 |
| 1 实验材料、试剂与仪器 | 第22-24页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第22-23页 |
| 1.2 主要试剂配制 | 第23-24页 |
| 1.3 主要仪器 | 第24页 |
| 2 实验方法 | 第24-29页 |
| 2.1 引物设计及合成 | 第24-26页 |
| 2.2 pCMV6-IDH2-WT重组载体的构建 | 第26-28页 |
| 2.2.1 IDH2-WT基因扩增 | 第26页 |
| 2.2.2 IDH2-WT基因和pCMV6载体双酶切及产物纯化回收 | 第26-27页 |
| 2.2.3 IDH2-WT基因和pCMV6载体双酶切片段的连接 | 第27页 |
| 2.2.4 TG1感受态细胞制备（CaCl2法） | 第27-28页 |
| 2.2.5 连接产物转化、重组质粒的提取、双酶切鉴定 | 第28页 |
| 2.2.6 pCMV6-IDH2-WT重组载体的测序及菌种保存 | 第28页 |
| 2.3 pCMV6-IDH2-R140/R172重组载体的构建 | 第28-29页 |
| 2.3.1 IDH2-R140/R172基因扩增 | 第28-29页 |
| 2.3.2 IDH2-R140/R172基因和pCMV6载体双酶切及产物纯化回收 | 第29页 |
| 2.3.3 IDH2-R140/R172基因和pCMV6载体双酶切片段的连接 | 第29页 |
| 2.3.4 连接产物转化、重组质粒的提取、双酶切鉴定 | 第29页 |
| 2.3.5 pCMV6-IDH2-R140/R172重组载体的测序及菌种保存 | 第29页 |
| 3 结果与分析 | 第29-33页 |
| 3.1 pCMV6-IDH2-WT重组载体的构建 | 第30-31页 |
| 3.2 pCMV6-IDH2-R140/R172重组载体的构建 | 第31-32页 |
| 3.3 重组载体pCMV6-IDH2-WT/R140/R172的序列测定 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-34页 |
| 第三章 细胞过表达野生型与突变体IDH2 | 第34-41页 |
| 1 实验材料、试剂与仪器 | 第34-37页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第34页 |
| 1.2 主要溶液的配制 | 第34-37页 |
| 1.3 主要仪器 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-40页 |
| 2.1 细胞复苏与传代 | 第37-38页 |
| 2.1.1 细胞复苏 | 第37页 |
| 2.1.2 细胞传代 | 第37-38页 |
| 2.2 细胞分盘 | 第38页 |
| 2.3 细胞转染实验 | 第38页 |
| 2.4 细胞裂解液的制备 | 第38页 |
| 2.5 蛋白浓度测定 | 第38-39页 |
| 2.5.1 标准曲线制作 | 第39页 |
| 2.5.2 样品蛋白浓度测定 | 第39页 |
| 2.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达与激活 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40页 |
| 3.1 细胞中过表达野生型与突变体IDH2 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-41页 |
| 第四章 过表达IDH2对 293T细胞代谢的影响 | 第41-48页 |
| 1 实验材料与试剂 | 第41页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第41页 |
| 1.2 主要溶液的配制 | 第41页 |
| 1.3 主要仪器 | 第41页 |
| 2 实验方法 | 第41-44页 |
| 2.1 酶活力的测定 | 第41-42页 |
| 2.2 乳酸测定 | 第42页 |
| 2.3 葡萄糖测定 | 第42-43页 |
| 2.4 活性氧测定 | 第43-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-46页 |
| 3.1 酶活力测定 | 第44页 |
| 3.2 乳酸含量测定 | 第44-45页 |
| 3.3 葡萄糖含量测定 | 第45-46页 |
| 3.4 ROS含量测定 | 第46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 第五章 野生型和突变体IDH2过表达对细胞信号通路的影响 | 第48-51页 |
| 1 实验材料与试剂 | 第48页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第48页 |
| 1.2 主要溶液的配制 | 第48页 |
| 2 实验方法 | 第48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-49页 |
| 3.1 过表达IDH2对细胞信号通路的影响 | 第48-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| 第六章 过表达的IDH2在 293T中的稳定性及结构预测分析 | 第51-57页 |
| 1 实验材料与试剂 | 第51页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第51页 |
| 1.2 主要溶液的配制 | 第51页 |
| 2 实验方法 | 第51-52页 |
| 2.1 药物抑制实验 | 第51页 |
| 2.2 Co-IP实验 | 第51-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-55页 |
| 3.1 Bortezomib对IDH2稳定性的影响 | 第52-53页 |
| 3.2 17-AAG对IDH2稳定性的影响 | 第53-54页 |
| 3.3 IDH2结构稳定性分析 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-57页 |
| 结论 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 硕士期间发表论文 | 第64-65页 |
| 硕士期间获奖情况 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
