| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1.1 链霉菌及多烯大环内酯类抗生素简介 | 第12-17页 |
| 1.2 济南霉素简介 | 第17页 |
| 1.3 链霉菌基因敲除方法简介 | 第17-18页 |
| 1.4 Red/ET重组工程简介 | 第18-22页 |
| 1.4.1 Red/ET重组的原理 | 第20-21页 |
| 1.4.2 Red/ET重组工程的操作步骤 | 第21页 |
| 1.4.3 Red/ET重组工程的应用 | 第21-22页 |
| 第二章 多烯大环内酯类抗生素济南霉素在纺锤链霉菌SD-07中的生物合成 | 第22-30页 |
| 2.1 济南霉素简介 | 第22页 |
| 2.2 济南霉素生物合成 | 第22-29页 |
| 2.2.1 纺锤链霉菌SD-07全基因组扫描测序 | 第22-26页 |
| 2.2.2 PKS基因 | 第26-28页 |
| 2.2.3 PKS后修饰和运输 | 第28页 |
| 2.2.4 细胞色素P450酶 | 第28-29页 |
| 2.2.5 糖基化 | 第29页 |
| 2.2.6 输出 | 第29页 |
| 2.2.7 其他基因 | 第29页 |
| 2.3 本章总结 | 第29-30页 |
| 第三章 纺锤链霉菌SD-07敲除载体的构建及基因敲除初探 | 第30-40页 |
| 3.1 研究背景 | 第30页 |
| 3.2 实验材料 | 第30-33页 |
| 3.2.1 菌株及质粒 | 第30-31页 |
| 3.2.2 PCR引物 | 第31页 |
| 3.2.3 培养基及化学试剂 | 第31-32页 |
| 3.2.4 抗生素及使用浓度 | 第32-33页 |
| 3.3 实验方法 | 第33-34页 |
| 3.3.1 大肠杆菌和链霉菌属间接合转移 | 第33页 |
| 3.3.2 PEG介导的原生质体转化 | 第33页 |
| 3.3.3 电转化实验步骤 | 第33页 |
| 3.3.4 敲除载体的构建 | 第33-34页 |
| 3.3.4.1 PCR扩增 | 第33-34页 |
| 3.3.4.2 PCR片段与载体的酶切连接 | 第34页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第34-38页 |
| 3.4.1 敲除载体pJTU1278-△2166以及pJTU12 78-△5883的构建 | 第34-36页 |
| 3.4.2 确定抗生素工作浓度 | 第36页 |
| 3.4.3 接合转移条件摸索 | 第36-37页 |
| 3.4.4 电转化条件摸索 | 第37-38页 |
| 3.4.5 PEG介导的原生质体转化法条件摸索 | 第38页 |
| 3.5 本章总结 | 第38-40页 |
| 第四章 纺锤链霉菌SD-07中PKS基因簇克隆的探索 | 第40-64页 |
| 4.1 研究背景 | 第40页 |
| 4.2 实验设计 | 第40-43页 |
| 4.3 实验材料 | 第43-46页 |
| 4.3.1 菌株及质粒 | 第43页 |
| 4.3.2 PCR引物 | 第43-45页 |
| 4.3.3 培养基及化学试剂 | 第45页 |
| 4.3.4 抗生素及使用浓度 | 第45页 |
| 4.3.5 实验仪器 | 第45-46页 |
| 4.3.6 DNA序列分析软件 | 第46页 |
| 4.4 实验方法 | 第46-57页 |
| 4.4.1 质粒DNA提取:BACs和质粒 | 第46-47页 |
| 4.4.2 链霉菌基因组DNA提取 | 第47-48页 |
| 4.4.3 纺锤链霉菌SD-07 Large part克隆 | 第48-55页 |
| 4.4.3.1 BAC线性载体的制备 | 第48-51页 |
| 4.4.3.1.1 11BACPCR扩增 | 第48页 |
| 4.4.3.1.2 12 pBeloBAC11载体酶切处理 | 第48-49页 |
| 4.4.3.1.3 过夜培养的大肠杆菌GBdir-gyrA462 | 第49页 |
| 4.4.3.1.4 制备大肠杆菌GBdir-gyrA462感受态细胞 | 第49页 |
| 4.4.3.1.5 构建载体13 pBeloBAC11 | 第49-50页 |
| 4.4.3.1.6 13 pBeloBAC11酶切处理 | 第50-51页 |
| 4.4.3.2 基因组DNA的限制性酶切以释放目标基因簇 | 第51-52页 |
| 4.4.3.3 过夜培养大肠杆菌GBdir+pSC101 | 第52页 |
| 4.4.3.4 制备大肠杆菌GBdir+pSC101感受态 | 第52-53页 |
| 4.4.3.5 T4 DNA聚合酶使基因组DNA的和线性载体初步重组 | 第53页 |
| 4.4.3.6 电穿孔法使基因组DNA的和线性载体导入大肠杆菌 | 第53-54页 |
| 4.4.3.7 限制酶切分析筛选出正确的重组子 | 第54-55页 |
| 4.4.4 纺锤链霉菌SD-07 Small part克隆 | 第55-57页 |
| 4.4.4.1 线性载体25 pBR322构建 | 第55-57页 |
| 4.4.4.1.1 载体25 pBR322组成片段PCR扩增 | 第55-56页 |
| 4.4.4.1.2 载体25 pBR322初步重组 | 第56页 |
| 4.4.4.1.3 构建载体25 pBR322 | 第56页 |
| 4.4.4.1.4 载体25 pBR322的酶切 | 第56-57页 |
| 4.4.4.2 基因组DNA的和线性载体初步重组 | 第57页 |
| 4.4.4.3 Small part克隆至载体25 pBR322 | 第57页 |
| 4.5 实验结果与分析讨论 | 第57-62页 |
| 4.5.1 Large part克隆及限制酶切筛选分析 | 第57-60页 |
| 4.5.1.1 SD-07基因组及Large part载体构建 | 第57-58页 |
| 4.5.1.2 Large part克隆酶切筛选 | 第58-60页 |
| 4.5.2 Small part克隆及限制酶切筛选分析 | 第60-62页 |
| 4.5.2.1 Small part载体构建 | 第60-61页 |
| 4.5.2.2 Small part克隆酶切筛选 | 第61-62页 |
| 4.6 本章总结 | 第62-64页 |
| 全文总结与展望 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附件 | 第75页 |
