| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 符号与缩略语说明 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 文献综述 | 第17-51页 |
| 第一章 有机磷农药的微生物降解研究 | 第17-38页 |
| 1 环境中有机磷农药的降解方式 | 第17-21页 |
| ·光催化降解 | 第17-19页 |
| ·化学降解 | 第19-20页 |
| ·水解 | 第19页 |
| ·氧化 | 第19-20页 |
| ·生物降解 | 第20-21页 |
| 2 降解有机磷农药的微生物种类 | 第21-22页 |
| 3 微生物降解有机磷农药的机理 | 第22-23页 |
| 4 影响微生物降解有机磷农药的因子 | 第23-25页 |
| ·理化因子 | 第23-24页 |
| ·生物化学因子 | 第24页 |
| ·底物浓度因子 | 第24-25页 |
| 5 有机磷降解酶基因及其研究进展 | 第25-27页 |
| 6 常见有机磷降解酶基因结构与功能的研究 | 第27-34页 |
| ·对硫磷水解酶(parathion hydrolase)的研究现状 | 第27-29页 |
| ·活性位点 | 第27页 |
| ·立体选择性和催化机理 | 第27-29页 |
| ·三维结构 | 第29页 |
| ·甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase,MPH)的研究现状 | 第29-31页 |
| ·有机磷水解酶的定向进化 | 第31-34页 |
| ·体外定向进化方法 | 第31-33页 |
| ·定向进化对有机磷水解酶的研究 | 第33-34页 |
| 7 有机磷农药微生物降解的实用化探索 | 第34-36页 |
| ·降解菌株的原位修复 | 第34-35页 |
| ·工程菌株的构建及应用 | 第35-36页 |
| ·酶制剂的研究 | 第36页 |
| 8 微生物降解有机磷农药的展望 | 第36-38页 |
| 第二章 毒死蜱的微生物降解研究进展 | 第38-43页 |
| 1 毒死蜱的主要物化性质及用途 | 第38-39页 |
| 2 毒死蜱的残留活性 | 第39-40页 |
| 3 毒死蜱的生态毒理 | 第40页 |
| 4 毒死蜱的降解机制 | 第40-41页 |
| 5 毒死蜱污染的生物修复技术 | 第41-43页 |
| 参考文献 | 第43-51页 |
| 实验部分 | 第51-129页 |
| 第一章 污染环境中毒死蜱降解菌的分离及其多样性 | 第51-71页 |
| 1 材料与方法 | 第51-56页 |
| ·菌株、培养基与试剂 | 第51页 |
| ·降解菌株的分离 | 第51-52页 |
| ·降解菌株的培养特征及生理生化鉴定 | 第52页 |
| ·降解菌株的16S rDNA序列的测定和鉴定 | 第52-54页 |
| ·菌体总DNA的提取 | 第52页 |
| ·降解菌株16S rDNA的PCR扩增 | 第52-53页 |
| ·PCR产物的T/A克隆 | 第53页 |
| ·普通感受态细胞的制备和转化 | 第53页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第53-54页 |
| ·16S rDNA序列测定 | 第54页 |
| ·降解菌株系统发育地位的确定 | 第54页 |
| ·降解菌ERIC-PCR指纹图谱的扩增 | 第54页 |
| ·菌株对毒死蜱的降解能力比较 | 第54-55页 |
| ·菌株的培养 | 第54页 |
| ·菌株在液体培养基中对毒死蜱的降解 | 第54-55页 |
| ·菌株在土壤中对毒死蜱的降解 | 第55页 |
| ·毒死蜱含量的检测 | 第55-56页 |
| ·毒死蜱中间产物TCP含量的检测 | 第56页 |
| ·有机磷降解谱实验 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-66页 |
| ·环境样品中毒死蜱降解菌株的分离筛选 | 第56-57页 |
| ·降解菌的菌落形态及生理生化特征 | 第57-60页 |
| ·降解菌株的基因组DNA提取 | 第60-61页 |
| ·降解菌株的系统发育地位 | 第61-63页 |
| ·降解菌ERIC-PCR指纹图谱 | 第63页 |
| ·降解菌的降解能力比较 | 第63-66页 |
| ·菌株在液体培养基中对毒死蜱的降解 | 第63-64页 |
| ·菌株在土壤中对毒死蜱的降解 | 第64-65页 |
| ·菌株降解毒死蜱的途径分析 | 第65-66页 |
| ·菌株对其它有机磷农药的降解 | 第66页 |
| 3 讨论 | 第66-68页 |
| 本章小结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-71页 |
| 第二章 毒死蜱降解关键基因的克隆与表达 | 第71-89页 |
| 1 材料与方法 | 第71-75页 |
| ·培养基与试剂 | 第71页 |
| ·菌株与质粒 | 第71页 |
| ·菌体总DNA的提取 | 第71-72页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第72页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第72页 |
| ·产物的酶连、转化与阳性克隆的筛选 | 第72页 |
| ·序列测定、比较与分析 | 第72-73页 |
| ·有机磷水解酶基因的PCR扩增 | 第73-74页 |
| ·有机磷水解酶基因表达载体的构建 | 第74页 |
| ·PCR产物和pET29a载体双酶切 | 第74页 |
| ·酶切产物的纯化、酶连、转化与筛选 | 第74页 |
| ·重组酶的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第74-75页 |
| ·样品处理 | 第74-75页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶的灌制 | 第75页 |
| ·电泳 | 第75页 |
| ·染色脱色 | 第75页 |
| 2 结果与分析 | 第75-85页 |
| ·PCR法克隆有机磷水解酶基因 | 第75-76页 |
| ·序列测定与比较分析 | 第76-82页 |
| ·基因水平上的比较 | 第76-80页 |
| ·氨基酸序列水平上的比较 | 第80-82页 |
| ·结构基因的表达与功能验证 | 第82-85页 |
| ·表达载体构建 | 第82-84页 |
| ·有机磷水解酶结构基因在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-86页 |
| 本章小结 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-89页 |
| 第三章 有机磷水解酶基因mpd的定向进化与功能分析 | 第89-105页 |
| 1 材料与方法 | 第89-93页 |
| ·材料 | 第89页 |
| ·随机突变方法 | 第89-90页 |
| ·酶活提高突变体的筛选 | 第90页 |
| ·定点突变方法 | 第90-92页 |
| ·突变引物 | 第90-91页 |
| ·扩增体系 | 第91页 |
| ·PCR反应条件 | 第91页 |
| ·PCR产物酶连转化 | 第91-92页 |
| ·序列测定与分析 | 第92页 |
| ·酶的纯化 | 第92-93页 |
| ·MPH酶活力测定方法 | 第93页 |
| ·平板法定性测定MPH的活性 | 第93页 |
| ·水解反应体系定量测定MPH的活性 | 第93页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第93页 |
| 2 结果与分析 | 第93-101页 |
| ·随机突变法获得对毒死蜱水解活力提高的突变体 | 第93-95页 |
| ·突变体酶MPH-Mn7与wild-type MPH的动力学参数比较 | 第95-96页 |
| ·定点突变 | 第96-99页 |
| ·突变位点的选择 | 第96-97页 |
| ·单位点突变体的构建 | 第97-98页 |
| ·突变体MPH对毒死蜱降解的酶动力学分析 | 第98-99页 |
| ·突变体酶结构的软件分析 | 第99-101页 |
| 3 讨论 | 第101-102页 |
| 本章小结 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-105页 |
| 第四章 毒死蜱污染环境的生物修复研究 | 第105-129页 |
| 第一节 菌株Dsp-1发酵条件的研究 | 第105-113页 |
| 1 材料与方法 | 第105-107页 |
| ·培养基与菌株 | 第105-106页 |
| ·最适培养条件的研究 | 第106-107页 |
| ·单因素最适生长条件的测定 | 第106页 |
| ·抗生素抗性试验 | 第106页 |
| ·生长曲线测定 | 第106-107页 |
| 2 结果与分析 | 第107-111页 |
| ·温度对菌株Dsp-1生长的影响 | 第107页 |
| ·pH对菌株Dsp-1生长的影响 | 第107-108页 |
| ·通气量对菌株Dsp-1生长的影响 | 第108页 |
| ·不同碳源对菌株Dsp-1生长的影响 | 第108-109页 |
| ·不同氮源对菌株Dsp-1生长的影响 | 第109页 |
| ·无机离子对菌株Dsp-1生长的影响 | 第109-110页 |
| ·C/N对Dsp-1生长的影响 | 第110页 |
| ·Dsp-1对抗生素的耐受性 | 第110-111页 |
| ·发酵培养基中生长曲线的测定 | 第111页 |
| 3 讨论 | 第111-113页 |
| 第二节 菌株Dsp-1对土壤中毒死蜱的降解 | 第113-119页 |
| 1 材料与方法 | 第113-115页 |
| ·菌株与培养基 | 第113页 |
| ·供试土壤 | 第113-114页 |
| ·土壤处理与接种 | 第114-115页 |
| ·土壤中毒死蜱的提取与测定 | 第115页 |
| 2 结果与分析 | 第115-118页 |
| ·Dsp-1在灭菌和不灭菌的土壤对毒死蜱的降解 | 第115-116页 |
| ·接种量对Dsp-1降解毒死蜱的影响 | 第116-117页 |
| ·Dsp-1对土壤中不同浓度毒死蜱的降解 | 第117页 |
| ·Dsp-1在不同类型土壤中对毒死蜱的降解效果 | 第117-118页 |
| 3 讨论 | 第118-119页 |
| 第三节 菌株Dsp-1对小青菜叶面毒死蜱残留的降解 | 第119-125页 |
| 1 材料与方法 | 第119-121页 |
| ·供试菌株 | 第119页 |
| ·试验方法 | 第119-120页 |
| ·农药提取与检测 | 第120-121页 |
| 2 结果与分析 | 第121-124页 |
| ·毒死蜱的添加回收率 | 第121页 |
| ·Dsp-1降解冬季叶菜毒死蜱残留的结果 | 第121-122页 |
| ·Dsp-1降解春季叶菜毒死蜱残留的结果 | 第122-124页 |
| 3 讨论 | 第124-125页 |
| 本章小结 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-129页 |
| 全文总结 | 第129-131页 |
| 论文创新点总结 | 第131-133页 |
| 附录一：实验用培养基及分子生物学试剂 | 第133-135页 |
| 附录二：发明专利证书 | 第135-137页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 | 第137-139页 |
| 致谢 | 第139页 |
