基因工程大肠杆菌发酵甘油生产丁醇的研究
| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第1章 前言 | 第11-19页 |
| ·正丁醇的理化性质和用途 | 第11页 |
| ·正丁醇的理化性质 | 第11页 |
| ·正丁醇的用途 | 第11页 |
| ·正丁醇的生产方法 | 第11-12页 |
| ·正丁醇的ABE生物发酵和机理 | 第12-13页 |
| ·ABE生物发酵的菌种 | 第12页 |
| ·ABE发酵生产丁醇的机理 | 第12-13页 |
| ·生物丁醇的研究进展 | 第13-15页 |
| ·丙酮丁醇梭状芽孢杆菌生产丁醇的研究进展 | 第13-14页 |
| ·基因工程菌生产丁醇的研究 | 第14-15页 |
| ·大肠杆菌甘油代谢途径 | 第15-16页 |
| ·本课题的研究目的、意义和主要内容 | 第16-19页 |
| ·本课题的研究日的和意义 | 第16-17页 |
| ·本课题研究的主要内容和技术路线 | 第17-19页 |
| 第2章 丁醇合成途径关键酶基因的克隆与表达 | 第19-40页 |
| ·实验材料 | 第19-22页 |
| ·菌株与质粒 | 第19页 |
| ·主要仪器和设备 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19-21页 |
| ·主要试剂配制 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-32页 |
| ·目的基因片段的PCR扩增 | 第22-24页 |
| ·目的基因与T载体的连接 | 第24页 |
| ·大肠杆菌高效感受态的制备 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第25页 |
| ·重组质粒DNA的抽提 | 第25页 |
| ·阳性克隆的PCR验证和酶切验证 | 第25页 |
| ·重组质粒pBT,pA,pAG的构建 | 第25-27页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第27-28页 |
| ·重组菌MG1655(DE3)的IPTG诱导表达 | 第28页 |
| ·粗酶液制备 | 第28页 |
| ·蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测表达结果 | 第28页 |
| ·丁醇合成途径关键酶活测定 | 第28-31页 |
| ·样品蛋白浓度测定 | 第31-32页 |
| ·结果与与讨论 | 第32-39页 |
| ·目的基因片段的扩增 | 第32-33页 |
| ·亚克隆重组质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| ·目的片段的双酶切 | 第34页 |
| ·重组质粒pBCS和pBT的构建 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pG,pA和pAG的构建 | 第35-37页 |
| ·阳性重组子的蛋白表达 | 第37-38页 |
| ·产丁醇的基因工程大肠杆菌的构建 | 第38页 |
| ·重组菌和原始菌酶活测定结果 | 第38-39页 |
| ·本章小结 | 第39-40页 |
| 第3章 大肠杆菌代谢副产物途径基因的敲除 | 第40-49页 |
| ·引言 | 第40页 |
| ·实验材料 | 第40页 |
| ·菌株与质粒 | 第40页 |
| ·PCR引物 | 第40页 |
| ·主要材料,试剂和设备 | 第40页 |
| ·实验方法 | 第40-44页 |
| ·同源重组过程 | 第40-41页 |
| ·PCR引物的设计 | 第41页 |
| ·打靶基因片段的PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·PCR目的产物的回收纯化 | 第42页 |
| ·纯化的PCR目的产物的酶切 | 第42页 |
| ·大肠杆菌的电击转化 | 第42-43页 |
| ·PCR鉴定卡那霉素抗性克隆 | 第43页 |
| ·卡那霉素抗性基因的消除 | 第43-44页 |
| ·结果与讨论 | 第44-48页 |
| ·打靶片段的PCR扩增 | 第44-45页 |
| ·打靶基因片段替换目的基因 | 第45-46页 |
| ·卡那霉素抗性基因消除 | 第46-48页 |
| ·本章小结 | 第48-49页 |
| 第4章 NADH再生系统在大肠杆菌中的构建 | 第49-57页 |
| ·前言 | 第49页 |
| ·实验材料 | 第49-50页 |
| ·菌株与质粒 | 第49页 |
| ·主要材料,试剂和设备 | 第49页 |
| ·本实验所用引物 | 第49-50页 |
| ·实验方法 | 第50-52页 |
| ·目的基因FDH1片段的PCR扩增 | 第50-51页 |
| ·目的基因与T载体的连接 | 第51页 |
| ·阳性克隆的菌液PCR验证 | 第51页 |
| ·重组质粒pF和pAF的构建 | 第51页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第51页 |
| ·重组菌的构建 | 第51-52页 |
| ·大肠杆菌甲酸脱氢酶基因的敲除 | 第52页 |
| ·实验结果与讨论 | 第52-56页 |
| ·目的基因片段的扩增 | 第52页 |
| ·克隆重组质粒的鉴定 | 第52-53页 |
| ·表达载体与目的基因片段的双酶切 | 第53页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第53-54页 |
| ·重组菌的获得 | 第54页 |
| ·大肠杆菌甲酸脱氢酶基因FDHF的敲除 | 第54-56页 |
| ·本章小结 | 第56-57页 |
| 第5章 构建的基因工程大肠杆菌发酵生产正丁醇 | 第57-66页 |
| ·前言 | 第57页 |
| ·实验仪器与材料 | 第57-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第57-58页 |
| ·主要材料,试剂,仪器和设备 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-61页 |
| ·菌株的活化 | 第58页 |
| ·种子培养 | 第58页 |
| ·发酵液菌株生长曲线的测定 | 第58页 |
| ·摇瓶发酵 | 第58页 |
| ·发酵液样品的处理 | 第58-59页 |
| ·气相色谱法测定发酵液中丁醇和乙醇的浓度 | 第59-60页 |
| ·高效液相色谱法测定有机酸的浓度 | 第60-61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-64页 |
| ·种子生长过程曲线及菌龄的确定 | 第61-62页 |
| ·摇瓶发酵培养基的确定 | 第62页 |
| ·构建的基因工程大肠杆菌发酵生产丁醇 | 第62-63页 |
| ·不同菌株发酵液副产物乙醇的产量 | 第63-64页 |
| ·不同菌株发酵液副产物有机酸的产量 | 第64页 |
| ·本章小结 | 第64-66页 |
| 第6章 展望和结论 | 第66-67页 |
| ·结论 | 第66页 |
| ·展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
