| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-28页 |
| 引言 | 第11页 |
| ·纤维素类生物质制备生物乙醇研究进展 | 第11-15页 |
| ·发展非粮燃料乙醇的必要性 | 第12页 |
| ·国内外纤维素乙醇产业化发展现状 | 第12-14页 |
| ·发展燃料乙醇的重要意义 | 第14页 |
| ·纤维素乙醇产业化亟待解决的技术问题及发展策略 | 第14-15页 |
| ·利用木质纤维素发酵生产乙醇的研究意义 | 第15-22页 |
| ·纤维素质原料生产乙醇的原理 | 第16页 |
| ·纤维素类物质的组成与结构 | 第16-18页 |
| ·纤维素结构与组成 | 第16-17页 |
| ·半纤维素结构和组成 | 第17页 |
| ·木质素结构和组成 | 第17-18页 |
| ·木质纤维素制取燃料乙醇的技术路线 | 第18-19页 |
| ·木质纤维素预处理 | 第18-19页 |
| ·水解和发酵工艺 | 第19页 |
| ·木质纤维及其组成部发酵菌种的选择 | 第19-20页 |
| ·L-有关阿拉伯糖的研究 | 第20-22页 |
| ·L-阿拉伯糖生产乙醇代谢途径 | 第20-21页 |
| ·L-阿拉伯糖异构酶 | 第21页 |
| ·L-阿拉伯糖的制备 | 第21-22页 |
| ·酵母表达系统研究进展 | 第22-26页 |
| ·酿酒酵母表达系统研究 | 第22-23页 |
| ·毕赤酵母研究进展 | 第23-26页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的特点 | 第24-25页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的启动子 | 第25-26页 |
| ·立题背景及意义 | 第26-27页 |
| ·技术路线 | 第27-28页 |
| 第二章 ai、rk、rpe基因的克隆 | 第28-43页 |
| 2. 材料与方法 | 第28-43页 |
| ·实验材料 | 第28-29页 |
| ·菌株和质粒 | 第28页 |
| ·工具酶、抗生素及试剂 | 第28页 |
| ·试剂盒 | 第28页 |
| ·溶液配制 | 第28-29页 |
| ·质粒提取试剂 | 第28-29页 |
| ·基因组DNA提取试剂 | 第29页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第29页 |
| ·培养基配制 | 第29页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-36页 |
| ·ai、rk、rpe基因的克隆 | 第30-32页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·模板质粒DNA的提取 | 第30-31页 |
| ·细菌基因组DNA的制备 | 第31页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第31-32页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| ·PCR产物回收连接转化测序 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的沉淀回收 | 第32页 |
| ·PCR产物的琼脂糖凝胶回收 | 第32-33页 |
| ·表达载体的构建 | 第33-35页 |
| ·PCR产物及载体质粒DNA的单酶切 | 第33页 |
| ·PCR产物及载体质粒DNA的双酶切 | 第33-34页 |
| ·PCR产物及载体质粒DNA的酶切回收 | 第34页 |
| ·目的片段与载体酶切后的连接 | 第34-35页 |
| ·E.coliDH5α感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·转化 | 第35页 |
| ·转化子的鉴定 | 第35-36页 |
| ·测序及序列分析 | 第36页 |
| ·结果与分析 | 第36-43页 |
| ·含ai、rk和rpe基因的毕赤酵母表达载体构建 | 第36-43页 |
| ·表达载体的构建模式 | 第36-37页 |
| ·含ai基因克隆与表达载体的构建 | 第37-38页 |
| ·含rk基因载体的构建 | 第38-40页 |
| ·含rpe基因载体的构建 | 第40-43页 |
| 第三章 AI、RK、RPE基因表达 | 第43-61页 |
| 3 材料与方法 | 第43-61页 |
| ·实验材料 | 第43-46页 |
| ·菌株 | 第43页 |
| ·酵母基本培养基 | 第43页 |
| ·酵母其他培养基贮存液 | 第43-44页 |
| ·发酵所用试剂 | 第44-45页 |
| ·蛋白电泳试剂 | 第45-46页 |
| ·阿拉伯糖发酵管制作试剂 | 第46页 |
| ·实验方法 | 第46-52页 |
| ·毕赤酵母和酿酒酵母的电转化 | 第46-47页 |
| ·电转化感受态细胞的制作 | 第46-47页 |
| ·重组质粒线性化 | 第47页 |
| ·电转化 | 第47页 |
| ·重组子的筛选 GS115/HIS+Mut+或HIS+Muts | 第47-48页 |
| ·重组子的鉴定 | 第48页 |
| ·重组酵母基因组提取 | 第48页 |
| ·重组酵母PCR鉴定 | 第48页 |
| ·高拷贝转化子的筛选 | 第48-49页 |
| ·重组酵母的摇瓶发酵表达 | 第49页 |
| ·组成型摇瓶表达 | 第49页 |
| ·诱导型摇瓶表达 | 第49页 |
| ·重组酵母的生物反应器发酵表达 | 第49-50页 |
| ·重组蛋白的检测 | 第50-52页 |
| ·重组蛋白的初步纯化 | 第50-51页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第51-52页 |
| ·酶活测定 | 第52页 |
| ·结果与分析 | 第52-61页 |
| ·含ai、rk、rpe基因的毕赤酵母工程菌构建 | 第52-56页 |
| ·转化毕赤酵母GS115 | 第52-54页 |
| ·重组酵母转化子鉴定 | 第54-56页 |
| ·筛选高拷贝重组转化子 | 第56页 |
| ·摇瓶发酵表达重组蛋白 | 第56-59页 |
| ·诱导型表达蛋白分析 | 第56-58页 |
| ·组成型表达蛋白分析 | 第58-59页 |
| ·重组蛋白酶活力测定 | 第59-61页 |
| ·P.pastoris表达产物的酶活测定 | 第59-60页 |
| ·酿酒酵母表达产物的酶活测定 | 第60-61页 |
| 第四章 讨论与结论 | 第61-65页 |
| ·讨论 | 第61-64页 |
| ·应用半纤维素的组成成分阿拉伯糖生产乙醇的前景 | 第61-62页 |
| ·毕赤酵母蛋白表达方式的选择 | 第62-63页 |
| ·毕赤酵母表达外源基因时启动子的应用 | 第63-64页 |
| ·结论 | 第64-65页 |
| ·ai、rk、rpe基因的克隆 | 第64页 |
| ·表达载体的构建 | 第64页 |
| ·工程菌的构建 | 第64页 |
| ·摇瓶发酵表达蛋白 | 第64页 |
| ·酶活力测定 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-72页 |
| 附录1:缩写词(ABBREVIATION) | 第72-73页 |
| 附录2 主要实验仪器 | 第73-74页 |
| 附录3 L-阿拉伯糖异构酶一级和二级结构分析 | 第74-78页 |
| 致谢 | 第78页 |