| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-37页 |
| ·海藻糖 | 第12-19页 |
| ·基本结构 | 第12页 |
| ·理化性质 | 第12-14页 |
| ·海藻糖在生物体内的作用和机理 | 第14-16页 |
| ·应用前景 | 第16页 |
| ·生产方法 | 第16-17页 |
| ·测定方法 | 第17-19页 |
| ·以葡萄糖为底物 | 第18页 |
| ·以麦芽糖为底物 | 第18页 |
| ·以淀粉为底物 | 第18-19页 |
| ·测定方法 | 第19页 |
| ·MTSase和 MTHase | 第19-24页 |
| ·双酶作用机理 | 第20-21页 |
| ·MTHase研究现况及蛋白质结构 | 第21-24页 |
| ·MTHase酶活测定方法 | 第24页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第24-31页 |
| ·大肠杆菌表达载体的构成 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌表达系统分类 | 第25-27页 |
| ·lac和tac表达系统 | 第25-26页 |
| ·PL和 PR表达系统 | 第26页 |
| ·T7表达系统 | 第26页 |
| ·组成型表达系统 | 第26-27页 |
| ·外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 | 第27-28页 |
| ·外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的策略 | 第28-31页 |
| ·载体的选择 | 第28-29页 |
| ·培养条件与诱导方法的选择 | 第29-31页 |
| ·从动力学角度实现外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达 | 第31页 |
| ·包涵体研究 | 第31-34页 |
| ·包涵体概念 | 第31-32页 |
| ·包涵体形成原因 | 第32页 |
| ·包涵体复性 | 第32-34页 |
| ·蛋白质复性机制研究 | 第34页 |
| ·本论文研究背景及思路 | 第34-37页 |
| ·本课题研究背景 | 第35-36页 |
| ·MTHase基因treZ的获得 | 第35页 |
| ·分析treZ基因编码蛋白结构及理化性质 | 第35-36页 |
| ·本课题研究目的及思路 | 第36-37页 |
| 第二章 诱导型融合表达载体和菌株的构建 | 第37-51页 |
| ·引言 | 第37-38页 |
| ·材料和方法 | 第38-41页 |
| ·菌株和质粒 | 第38-39页 |
| ·仪器、试剂盒、工具酶、化学试剂 | 第39页 |
| ·PCR引物 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·菌株的培养和诱导表达 | 第40页 |
| ·细胞破碎方法 | 第40页 |
| ·其它实验方法 | 第40-41页 |
| ·构建表达质粒pET-MTH | 第41-46页 |
| ·玫瑰微球菌 QS412基因组模板 DNA的抽提 | 第41页 |
| ·MTHase酶基因(TreZ)的扩增 | 第41-42页 |
| ·pET-28a(+)质粒提取及酶切 | 第42页 |
| ·对 PCR产物进行双酶切 | 第42-43页 |
| ·定向连接 | 第43页 |
| ·E.coli感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| ·连接产物转化 | 第44页 |
| ·阳性转化子的筛选鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组质粒构建思路及图谱 | 第45页 |
| ·重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-MTH)的构建 | 第45-46页 |
| ·实验结果与讨论 | 第46-50页 |
| ·PCR扩增及产物回收 | 第46页 |
| ·重组质粒筛选 | 第46-48页 |
| ·重组质粒测序 | 第48-49页 |
| ·重组菌 E.coli BL21(pET-MTH)的构建 | 第49-50页 |
| ·本章小结 | 第50-51页 |
| 第三章 MTHase融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第51-69页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·实验材料 | 第51-52页 |
| ·菌株、质粒、和培养基 | 第51页 |
| ·试剂及其配置 | 第51-52页 |
| ·实验方法 | 第52-55页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第52页 |
| ·生长曲线的测定 | 第52-53页 |
| ·诱导表达条件优化 | 第53-54页 |
| ·菌体破碎 | 第54页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第54页 |
| ·MTHase酶活的测定 | 第54页 |
| ·乳糖诱导 | 第54-55页 |
| ·结果与讨论 | 第55-64页 |
| ·诱导重组菌株表达蛋白 | 第55-57页 |
| ·重组蛋白酶活测定 | 第57-59页 |
| ·诱导条件优化 | 第59-61页 |
| ·乳糖诱导尝试 | 第61-64页 |
| ·包涵体复性研究 | 第64-68页 |
| ·蛋白表达 | 第64页 |
| ·包涵体的制备 | 第64-65页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第65页 |
| ·包涵体的溶解 | 第65页 |
| ·结果与分析 | 第65-68页 |
| ·包涵体洗涤 | 第65-66页 |
| ·包涵体透析复性 | 第66页 |
| ·复性后酶活测定 | 第66-68页 |
| ·本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 MTHase酶的组成型表达尝试 | 第69-84页 |
| ·引言 | 第69页 |
| ·重组质粒pGEMKT-HPRf-ACY介绍 | 第69-70页 |
| ·材料和方法 | 第70-72页 |
| ·菌株和质粒 | 第70-71页 |
| ·仪器与试剂 | 第71页 |
| ·培养基 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-72页 |
| ·组成型表达载体pGEMKT-HPf-MTH的构建 | 第72-76页 |
| ·MTHase酶基因的扩增 | 第72-73页 |
| ·对 PCR产物进行酶切 | 第73页 |
| ·pGEMKT-HPfACY质粒提取及酶切 | 第73-74页 |
| ·定向连接 | 第74-75页 |
| ·将重组质粒转化不同大肠杆菌 | 第75页 |
| ·重组菌的培养 | 第75页 |
| ·酶活检测 | 第75-76页 |
| ·实验结果与讨论 | 第76-83页 |
| ·PCR扩增及产物回收 | 第76-77页 |
| ·PCR产物酶切 | 第77页 |
| ·pGEMKT-HPf质粒酶切及回收 | 第77-79页 |
| ·重组质粒筛选及测序 | 第79页 |
| ·检测蛋白表达 | 第79-80页 |
| ·检测酶活 | 第80-83页 |
| ·本章小结 | 第83-84页 |
| 第五章 结论 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-90页 |
| 附录 | 第90-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第97页 |
