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HCMV UL138、UL139和UL140基因在低传代临床分离株中表达和功能的初步研究

摘要第1-8页
Abstract第8-9页
一.前言第9-20页
 1.人巨细胞病毒简介第9页
 2.HCMV的病毒学特征第9-11页
 3.BAC-HCMV的构建与简介第11-14页
 4.HCMV UL/b'区基因简介第14-15页
 5.HCMV pp71蛋白功能简介第15-19页
   ·HCMV的复制过程第15-16页
   ·病毒的转录激活第16-17页
   ·pp71对病毒转录激活的影响第17-18页
   ·pp71对宿主细胞周期的影响第18-19页
 6.课题意义第19-20页
二.技术路线第20-21页
三.实验仪器与材料第21-24页
 1.主要仪器第21页
 2.实验材料第21-24页
   ·细胞、菌种与质粒第21-22页
   ·引物和测序第22页
   ·主要试剂第22-23页
   ·其它主要试剂的配方第23-24页
四.实验方法第24-41页
 1.BAC-HCMV质粒的抽提与纯化第24-25页
 2.pcDNA-pp71的构建第25-29页
   ·UL82基因的引物的设计第25-26页
   ·UL82基因的扩增第26页
   ·PCR产物纯化,回收第26页
   ·回收产物双酶切第26-27页
   ·目标质粒pcDNA3.1(+)双酶切第27页
   ·外源基因和载体的连接第27-28页
   ·感受态宿主菌的制备第28页
   ·重组子的转化第28-29页
 3.细胞培养第29-30页
   ·Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)培养基的配制:第29页
   ·细胞培养第29-30页
   ·细胞传代第30页
 4.细胞转染第30-31页
   ·脂质体转染第30-31页
   ·细胞电转第31页
 5.病毒的培养第31-32页
 6.病毒DNA的提取第32-33页
 7.HCMV总RNA的提取第33页
 8.HCMV RNA的纯化第33-34页
 9.HCMV RNA的鉴定第34-36页
   ·HCMV IE基因引物设计第34页
   ·HCMV mRNA逆转录成cDNA第34-35页
   ·PCR鉴定HCMV IE基因mRNA第35-36页
 10.UL138基因的RT-PCR扩增第36-37页
 11.UL139基因的RT-PCR扩增第37-39页
 12.UL140基因的RT-PCR扩增第39-40页
 10.RT-PCR产物TA克隆第40-41页
五.结果与分析第41-64页
 1.BAC-HCMV质粒的抽提与纯化第41页
 2.BAC-HCMV质粒的鉴定第41页
 3.pcDNA-pp71的构建第41-44页
   ·UL82基因的扩增第43页
   ·pcDNA-pp71的酶切鉴定第43-44页
 4.病毒的分离与培养第44-47页
   ·人胚肺成纤维细胞培养结果第44页
   ·转染BAC-HCMV和pcDNA-pp71后人胚肺细胞出现病变效应第44-47页
 5.病变细胞HCMV的鉴定第47-50页
   ·HCMV-IE立刻早期基因PCR鉴定第47-48页
   ·HCMV-UL138、UL139和UL140基因PCR鉴定第48-50页
 6.HCMV RNA的提取第50页
 7.通过RT-PCR技术鉴定HCMV mRNA的表达第50-51页
 8.RT-PCR鉴定UL138、UL139、UL140基因的表达第51-54页
   ·UL138基因表达的鉴定第51-52页
   ·UL139基因表达的鉴定第52-53页
   ·UL140基因表达的鉴定第53-54页
   ·UL138、UL139、UL140基因RT-PCR产物的TA克隆及测序第54页
 9.UL138、UL139、UL140基因的功能预测第54-64页
   ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白等电点与分子量预测第54-55页
   ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白翻译后修饰位点分析第55-56页
   ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白质信号肽预测第56-58页
   ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白质跨膜结构域预测第58-60页
   ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白质同源性分析第60-64页
六.讨论第64-69页
 1.BAC-HCMV的抽提与纯化第64页
 2.pcDNA-pp71的构建第64-65页
 3.病毒的分离和培养第65-66页
 4.病毒的鉴定第66页
 5.病毒mRNA的检测第66-67页
 6.UL138、UL139、UL140基因编码产物分析第67-69页
七.小结第69-70页
八.附录第70-81页
 附录1 GeneBank公布的UL82基因全序列第70-72页
 附录2 pcDNA-UL82的测序结果第72-75页
 附录3 GeneBank公布的UL138基因全序列第75-76页
 附录4 UL138的测序结果第76-77页
 附录5 GeneBank公布的UL139基因全序列第77-78页
 附录6 UL139的测序结果第78-79页
 附录7 GeneBank公布的UL140基因全序列第79-80页
 附录8 UL140的测序结果第80-81页
九.参考文献第81-86页
十致谢第86页

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