| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 一.前言 | 第9-20页 |
| 1.人巨细胞病毒简介 | 第9页 |
| 2.HCMV的病毒学特征 | 第9-11页 |
| 3.BAC-HCMV的构建与简介 | 第11-14页 |
| 4.HCMV UL/b'区基因简介 | 第14-15页 |
| 5.HCMV pp71蛋白功能简介 | 第15-19页 |
| ·HCMV的复制过程 | 第15-16页 |
| ·病毒的转录激活 | 第16-17页 |
| ·pp71对病毒转录激活的影响 | 第17-18页 |
| ·pp71对宿主细胞周期的影响 | 第18-19页 |
| 6.课题意义 | 第19-20页 |
| 二.技术路线 | 第20-21页 |
| 三.实验仪器与材料 | 第21-24页 |
| 1.主要仪器 | 第21页 |
| 2.实验材料 | 第21-24页 |
| ·细胞、菌种与质粒 | 第21-22页 |
| ·引物和测序 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22-23页 |
| ·其它主要试剂的配方 | 第23-24页 |
| 四.实验方法 | 第24-41页 |
| 1.BAC-HCMV质粒的抽提与纯化 | 第24-25页 |
| 2.pcDNA-pp71的构建 | 第25-29页 |
| ·UL82基因的引物的设计 | 第25-26页 |
| ·UL82基因的扩增 | 第26页 |
| ·PCR产物纯化,回收 | 第26页 |
| ·回收产物双酶切 | 第26-27页 |
| ·目标质粒pcDNA3.1(+)双酶切 | 第27页 |
| ·外源基因和载体的连接 | 第27-28页 |
| ·感受态宿主菌的制备 | 第28页 |
| ·重组子的转化 | 第28-29页 |
| 3.细胞培养 | 第29-30页 |
| ·Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)培养基的配制: | 第29页 |
| ·细胞培养 | 第29-30页 |
| ·细胞传代 | 第30页 |
| 4.细胞转染 | 第30-31页 |
| ·脂质体转染 | 第30-31页 |
| ·细胞电转 | 第31页 |
| 5.病毒的培养 | 第31-32页 |
| 6.病毒DNA的提取 | 第32-33页 |
| 7.HCMV总RNA的提取 | 第33页 |
| 8.HCMV RNA的纯化 | 第33-34页 |
| 9.HCMV RNA的鉴定 | 第34-36页 |
| ·HCMV IE基因引物设计 | 第34页 |
| ·HCMV mRNA逆转录成cDNA | 第34-35页 |
| ·PCR鉴定HCMV IE基因mRNA | 第35-36页 |
| 10.UL138基因的RT-PCR扩增 | 第36-37页 |
| 11.UL139基因的RT-PCR扩增 | 第37-39页 |
| 12.UL140基因的RT-PCR扩增 | 第39-40页 |
| 10.RT-PCR产物TA克隆 | 第40-41页 |
| 五.结果与分析 | 第41-64页 |
| 1.BAC-HCMV质粒的抽提与纯化 | 第41页 |
| 2.BAC-HCMV质粒的鉴定 | 第41页 |
| 3.pcDNA-pp71的构建 | 第41-44页 |
| ·UL82基因的扩增 | 第43页 |
| ·pcDNA-pp71的酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 4.病毒的分离与培养 | 第44-47页 |
| ·人胚肺成纤维细胞培养结果 | 第44页 |
| ·转染BAC-HCMV和pcDNA-pp71后人胚肺细胞出现病变效应 | 第44-47页 |
| 5.病变细胞HCMV的鉴定 | 第47-50页 |
| ·HCMV-IE立刻早期基因PCR鉴定 | 第47-48页 |
| ·HCMV-UL138、UL139和UL140基因PCR鉴定 | 第48-50页 |
| 6.HCMV RNA的提取 | 第50页 |
| 7.通过RT-PCR技术鉴定HCMV mRNA的表达 | 第50-51页 |
| 8.RT-PCR鉴定UL138、UL139、UL140基因的表达 | 第51-54页 |
| ·UL138基因表达的鉴定 | 第51-52页 |
| ·UL139基因表达的鉴定 | 第52-53页 |
| ·UL140基因表达的鉴定 | 第53-54页 |
| ·UL138、UL139、UL140基因RT-PCR产物的TA克隆及测序 | 第54页 |
| 9.UL138、UL139、UL140基因的功能预测 | 第54-64页 |
| ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白等电点与分子量预测 | 第54-55页 |
| ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白翻译后修饰位点分析 | 第55-56页 |
| ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白质信号肽预测 | 第56-58页 |
| ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白质跨膜结构域预测 | 第58-60页 |
| ·UL138、UL139、UL140基因编码蛋白质同源性分析 | 第60-64页 |
| 六.讨论 | 第64-69页 |
| 1.BAC-HCMV的抽提与纯化 | 第64页 |
| 2.pcDNA-pp71的构建 | 第64-65页 |
| 3.病毒的分离和培养 | 第65-66页 |
| 4.病毒的鉴定 | 第66页 |
| 5.病毒mRNA的检测 | 第66-67页 |
| 6.UL138、UL139、UL140基因编码产物分析 | 第67-69页 |
| 七.小结 | 第69-70页 |
| 八.附录 | 第70-81页 |
| 附录1 GeneBank公布的UL82基因全序列 | 第70-72页 |
| 附录2 pcDNA-UL82的测序结果 | 第72-75页 |
| 附录3 GeneBank公布的UL138基因全序列 | 第75-76页 |
| 附录4 UL138的测序结果 | 第76-77页 |
| 附录5 GeneBank公布的UL139基因全序列 | 第77-78页 |
| 附录6 UL139的测序结果 | 第78-79页 |
| 附录7 GeneBank公布的UL140基因全序列 | 第79-80页 |
| 附录8 UL140的测序结果 | 第80-81页 |
| 九.参考文献 | 第81-86页 |
| 十致谢 | 第86页 |
