| 中文摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-30页 |
| 1 基因治疗对靶向技术的要求 | 第14页 |
| 2 传统的克隆技术与Red重组系统 | 第14-16页 |
| 3 DNA复制 | 第16-17页 |
| 4 原核细胞中DNA的转录 | 第17页 |
| 5 细菌的同源重组 | 第17-18页 |
| 6 DNA错配修复系统 | 第18-20页 |
| 7 转录偶联修复系统 | 第20-21页 |
| 8 核苷酸剪切修复 | 第21-23页 |
| 9 酵母细胞中单链寡聚核苷酸介导的靶向技术的链差异 | 第23-24页 |
| 10 RNA／DNA(RDO)介导的靶向技术 | 第24-25页 |
| 11 ThyA报告系统的建立 | 第25-29页 |
| ·ThyA筛选系统的机理 | 第25-26页 |
| ·正筛选系统 | 第26页 |
| ·负筛选系统 | 第26-29页 |
| 12 本研究的设计 | 第29-30页 |
| 材料和方法 | 第30-66页 |
| 1 材料 | 第30-35页 |
| ·培养基 | 第30页 |
| ·抗生素 | 第30-31页 |
| ·菌株 | 第31-32页 |
| ·单链寡聚核苷酸 | 第32-35页 |
| ·主要试剂盒 | 第35页 |
| ·主要溶液 | 第35页 |
| 2 实验方法 | 第35-66页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·细胞的转化 | 第36页 |
| ·PCR反应 | 第36页 |
| ·电泳 | 第36页 |
| ·DNA的纯化 | 第36页 |
| ·质粒的纯化 | 第36页 |
| ·构建质粒报告系统 | 第36-39页 |
| ·构建质粒pmKan | 第36-37页 |
| ·构建质粒p(-)mKan | 第37-38页 |
| ·构建质粒p(+)mKan | 第38-39页 |
| ·在DY380中用单链寡聚核苷酸对质粒报告系统进行靶向突变 | 第39-44页 |
| ·打靶单链寡聚核苷酸的设计 | 第39-41页 |
| ·共转化研究单链寡聚核苷酸进行的靶向突变 | 第41-43页 |
| ·纠正效率的计算方法 | 第43页 |
| ·顺次转化研究单链寡聚核苷酸进行的靶向突变 | 第43-44页 |
| ·染色体报告系统的构建 | 第44-47页 |
| ·构建DY380△MutS菌株 | 第44-45页 |
| ·构建DY380(+)和DY380(-)菌株 | 第45-47页 |
| ·构建DY380(+)△MutS和DY380(-)△MutS菌株 | 第47页 |
| ·对RED重组系统有影响的候选基因的敲除 | 第47-50页 |
| ·敲除MutL基因 | 第47-48页 |
| ·敲除MutH基因 | 第48-49页 |
| ·敲除Mfd基因 | 第49页 |
| ·敲除UvrB基因 | 第49-50页 |
| ·其它位点的验证—突变ThyA基因 | 第50页 |
| ·单链寡聚核苷酸在重组过程中直接掺入的证据 | 第50-57页 |
| ·单链寡聚核苷酸在重组过程中直接掺入 | 第50-52页 |
| ·构建含有温度敏感型复制起点的质粒p~(ts)mKan | 第52-53页 |
| ·RED重组系统活性的稳定性 | 第53-57页 |
| ·转录对RED重组系统的影响 | 第57-66页 |
| ·研究转录对RED重组系统影响报告系统的构建 | 第57页 |
| ·构建PALA1172-Lac-Kan质粒 | 第57-59页 |
| ·构建PALA1172-Lac-mKan质粒 | 第59-62页 |
| ·构建PGK-frt-lac-mKan质粒 | 第62-63页 |
| ·构建PGK-frt-LacI质粒 | 第63-64页 |
| ·构建p(+)LacmKan和p(-)LacmKan质粒 | 第64-66页 |
| 实验结果 | 第66-100页 |
| 1 构建pmKan报告系统 | 第66-68页 |
| 2 构建p(+)mKan和p(-)mKan报告系统 | 第68-69页 |
| 3 质粒报告系统中的打靶效率 | 第69-72页 |
| 4 在DY380中敲除MutS基因 | 第72-73页 |
| 5 DY380△MutS中质粒报告系统的打靶效率 | 第73-75页 |
| 6 构建DY380(+)和DY380(-)染色体报告系统 | 第75-77页 |
| 7 DY380(+)和DY380(-)染色体报告系统中的打靶效率 | 第77-80页 |
| 8 敲除DY380中MutL,MutH基因 | 第80-83页 |
| 9 DY380ΔMutS,DY380ΔMutL,DY380ΔMutH染色体报告系统中的打靶效率 | 第83页 |
| 10 敲除DY380中的Mfd基因 | 第83-85页 |
| 11 敲除DY380中的UvrB基因 | 第85-87页 |
| 12 DY380ΔMfd,DY380ΔUvrB染色体报告系统中的打靶效率 | 第87页 |
| 13 ThyA基因中的打靶效率 | 第87-88页 |
| 14 证明oligo直接掺入的PCR证据 | 第88-89页 |
| 15 证明Red重组系统稳定性的打靶效率图 | 第89-90页 |
| 16 证明Red重组系统与DNA复制相关的打靶效率图 | 第90-91页 |
| 17 转录报告系统的构建 | 第91-100页 |
| ·构建质粒PALA1172-lac-Kan | 第91-92页 |
| ·构建质粒PALA1172-lac-mKan | 第92-95页 |
| ·构建PGK-frt-lac-mKan | 第95-96页 |
| ·构建PGK-frt-lacⅠ | 第96-98页 |
| ·DY380中转录报告系统打靶效率图 | 第98-100页 |
| 讨论 | 第100-110页 |
| 1 单链寡聚核苷酸对质粒报告系统的纠正效率的差异 | 第100-101页 |
| 2 单链寡聚核苷酸对染色体报告系统的纠正效率的差异 | 第101-102页 |
| 3 质粒的浓度,Oligo的浓度,Oligo的长度对效率的影响 | 第102-103页 |
| ·pmKan报告系统 | 第102-103页 |
| ·染色体报告系统 | 第103页 |
| 4 DNA错配修复系统对RED重组系统的影响 | 第103-104页 |
| 5 RED重组系统的稳定性及与DNA复制的关系 | 第104-105页 |
| ·RED重组系统的稳定性 | 第104页 |
| ·RED重组系统与DNA复制的关系 | 第104-105页 |
| 6 Oligo可以在DNA复制的过程中直接掺入到新生的DNA链中的证据 | 第105-106页 |
| 7 转录对RED重组系统的影响 | 第106页 |
| 8 ThyA报告系统结果分析 | 第106-107页 |
| 9 DNA剪切修复和转录偶联的修复对RED重组系统没有影响 | 第107-108页 |
| 10 RED重组系统可能的机理 | 第108页 |
| 11 RED重组系统介导的靶向突变应用前景 | 第108-110页 |
| 小结 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-113页 |
| 文献综述 | 第113-124页 |
| 1 酵母中的重组系统 | 第113-114页 |
| 2 大肠杆菌中的重组系统 | 第114-117页 |
| 3 噬菌体中的重组系统 | 第117-124页 |
| ·Rac编码的RecET系统 | 第117页 |
| ·λ编码的Red系统 | 第117-124页 |
| 英文名词及缩写 | 第124-126页 |
| 个人简历 | 第126-127页 |
