| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-49页 |
| 第一节 微生物表面展示技术概述 | 第16-31页 |
| 1 噬菌体展示系统 | 第17页 |
| 2 细菌表面展示系统 | 第17-18页 |
| 3 酵母菌表面展示系统 | 第18-31页 |
| ·酵母菌表面展示技术的背景知识 | 第18-22页 |
| ·常见酵母菌表面展示系统 | 第22-24页 |
| ·酵母菌表面展示的一般思路 | 第24-25页 |
| ·酵母菌表面展示技术的应用 | 第25-31页 |
| ·展望 | 第31页 |
| 第二节 酵母菌表达系统 | 第31-45页 |
| 1 酒精酵母菌表达系统 | 第31-32页 |
| 2 毕赤酵母菌表达系统 | 第32页 |
| 3 粟酒裂殖酵母菌表达系统 | 第32-33页 |
| 4 解脂耶罗威亚酵母菌表达系统 | 第33-45页 |
| ·表达载体 | 第34-36页 |
| ·宿主菌 | 第36-38页 |
| ·常见Y. lipolytica 基因表达系统介绍 | 第38-45页 |
| 第三节 研究背景、内容及意义 | 第45-49页 |
| 第二章 解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建及表达验证 | 第49-81页 |
| 第一节 解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建 | 第49-67页 |
| 0 前言 | 第49-50页 |
| 1 实验设计 | 第50-56页 |
| ·Y. lipolytica 中的细胞壁蛋白YlCwp1 | 第50-53页 |
| ·Y. lipolytica 表达载体pINA1317 及其宿主P01h 菌株 | 第53-55页 |
| ·技术路线 | 第55-56页 |
| 2 材料与方法 | 第56-64页 |
| ·试剂 | 第56-57页 |
| ·培养基 | 第57页 |
| ·菌株和质粒 | 第57页 |
| ·YlCwp1C 端编码基因的PCR 扩增 | 第57-61页 |
| ·重组质粒pMD19-ylcwp110 和pMD19-ylcwp131 的构建 | 第61-63页 |
| ·YlCwp1 C 端编码基因（ylcwp110 和ylcwp131）片段与质粒pINA1317连接 | 第63-64页 |
| 3 结果与讨论 | 第64-67页 |
| ·YlCwp1 C 端编码基因扩增结果 | 第64页 |
| ·基于pINA1317 的表面展示质粒构建结果 | 第64-67页 |
| 第二节 增强型绿色荧光蛋白在解脂耶罗威亚细胞表面的展示——表面展示质粒的验证 | 第67-80页 |
| 0 前言 | 第67页 |
| 1 材料与方法 | 第67-72页 |
| ·材料 | 第67-68页 |
| ·方法 | 第68-72页 |
| 2 结果与讨论 | 第72-80页 |
| ·EGFP 表面展示质粒的构建 | 第72-74页 |
| ·含egfp 的表面展示质粒片段转化Y. lipolytica P01h | 第74页 |
| ·Y. lipolytica P01h 转化结果 | 第74-76页 |
| ·阳性Y. lipolytica 转化子荧光检测 | 第76-80页 |
| 本章小结 | 第80-81页 |
| 第三章 海洋酵母菌Kodamaea ohmeri BG3 植酸酶在Yarrowia lipolytica 中的分泌表达和表面展示 | 第81-108页 |
| 第一节 前言 | 第81-83页 |
| 第二节 海洋酵母菌Kodamaea ohmeri BG3植酸酶在Yarrowia lipolytica中的分泌表达 | 第83-98页 |
| 1 材料 | 第83页 |
| ·试剂与培养基 | 第83页 |
| ·菌株和质粒 | 第83页 |
| 2 方法 | 第83-91页 |
| ·K. ohmeri BG3 植酸酶在Y. lipolytica 中分泌表达流程图 | 第83-84页 |
| ·PCR 扩增K. ohmeri BG3 植酸酶编码基因PHY1 | 第84-85页 |
| ·质粒提取 | 第85页 |
| ·Y. lipolytica P01h 转化 | 第85页 |
| ·Y. lipolytica P01h 转化子植酸酶活力测定 | 第85-86页 |
| ·重组植酸酶酶学性质 | 第86-87页 |
| ·重组植酸酶的纯化 | 第87页 |
| ·纯化的植酸酶SDS-PAGE 及Western blotting 分析 | 第87-91页 |
| 3 结果与讨论 | 第91-98页 |
| ·K. ohmeri 植酸酶分泌表达质粒构建 | 第91-92页 |
| ·含PHY1 大片段转化Y. lipolytica P01h 及转化子筛选 | 第92-93页 |
| ·重组植酸酶性质研究 | 第93-95页 |
| ·金属离子对重组植酸酶酶活的影响 | 第95-96页 |
| ·蛋白抑制剂对重组植酸酶酶活的影响 | 第96页 |
| ·重组植酸酶的分离纯化 | 第96-98页 |
| 第三节 海洋酵母菌Kodamaea ohmeri BG3植酸酶在Yarrowia lipolytica中的表面展示 | 第98-108页 |
| 1 材料 | 第98页 |
| 2 方法 | 第98-100页 |
| ·PCR 扩增K. ohmeri 植酸酶编码基因PHY1 | 第98-99页 |
| ·质粒提取 | 第99页 |
| ·Y. lipolytica P01h 转化 | 第99页 |
| ·转化子植酸酶活力测定 | 第99页 |
| ·细胞免疫荧光反应 | 第99-100页 |
| 3 结果与讨论 | 第100-106页 |
| ·K. ohmeri BG3 植酸酶表面展示质粒构建 | 第100-101页 |
| ·阳性Y. lipolytica 转化子筛选及鉴定 | 第101-102页 |
| ·表面展示植酸酶性质研究 | 第102-105页 |
| ·金属离子对表面展示植酸酶酶活的影响 | 第105-106页 |
| 本章小结 | 第106-108页 |
| 第四章 哈维氏弧菌溶血素蛋白在Y. lipolytica细胞表面的展示及其对大西洋牙鲆免疫效果的研究 | 第108-131页 |
| 第一节 前言 | 第108-111页 |
| 第二节 哈维氏弧菌溶血素蛋白在Y. lipolytica 细胞表面的展示 | 第111-117页 |
| 1 材料 | 第111页 |
| ·培养基与试剂 | 第111页 |
| ·菌株和质粒 | 第111页 |
| ·实验动物 | 第111页 |
| 2 方法 | 第111-114页 |
| ·PCR 扩增哈维氏弧菌溶血素蛋白（VHH）编码基因HL-1 | 第112-113页 |
| ·质粒提取 | 第113页 |
| ·Y. lipolytica P01h 转化 | 第113页 |
| ·Y. lipolytica P01h 转化子溶血活性测定 | 第113-114页 |
| 3 结果与讨论 | 第114-117页 |
| ·哈维氏弧菌溶血素蛋白（VHH）表面展示质粒构建 | 第114页 |
| ·含HL-1 大片段转化Y. lipolytica P01h 及溶血活性测定 | 第114-116页 |
| ·免疫荧光验证VHH 在Y. lipolytica P01h 表面的展示 | 第116-117页 |
| 第三节 以 Y. lipolytica 为载体的哈维氏弧菌溶血素基因工程活疫苗接种养殖大西洋牙鲆后的抗体应答水平研究 | 第117-129页 |
| 1 材料 | 第117页 |
| ·实验动物 | 第117页 |
| ·实验材料与试剂 | 第117页 |
| ·菌株 | 第117页 |
| 2 方法 | 第117-124页 |
| ·活疫苗的制备 | 第117-118页 |
| ·免疫接种 | 第118页 |
| ·免疫效果的检测 | 第118-124页 |
| 3 结果与讨论 | 第124-129页 |
| ·重组VHH 纯化结果 | 第124页 |
| ·疫苗对鱼体的安全性 | 第124-125页 |
| ·大西洋牙鲆血清免疫球蛋白IgM 的纯化 | 第125-127页 |
| ·免疫斑点法测定小鼠抗大西洋牙鲆IgM 多克隆抗体效价 | 第127页 |
| ·间接ELISA 检测大西洋牙鲆对溶血素蛋白特异抗体的产生 | 第127-129页 |
| 本章小结 | 第129-131页 |
| 总结与创新点 | 第131-132页 |
| 展望 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-144页 |
| 附录：英文缩写符号中英文名称对照表 | 第144-146页 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 | 第146-148页 |
| 致谢 | 第148页 |
