| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 前言 | 第8-11页 |
| 第一部分 hTNF蛋白的表达及纯化 | 第11-22页 |
| 一 实验材料 | 第11-12页 |
| ·主要实验仪器 | 第11页 |
| ·主要实验试剂 | 第11页 |
| ·菌株 | 第11-12页 |
| 二、实验方法 | 第12-18页 |
| ·hTNFα蛋白的表达及纯化 | 第12-15页 |
| ·目的蛋白的表达 | 第12页 |
| ·目的蛋白表达部位的摸索 | 第12-13页 |
| ·hTNFα蛋白最佳表达条件的摸索 | 第13页 |
| ·hTNFα蛋白的大量表达 | 第13-14页 |
| ·细菌裂解及透析 | 第14页 |
| ·表达产物的分离纯化 | 第14-15页 |
| ·蛋白浓缩及活性检测 | 第15-18页 |
| ·BCA试剂盒测定纯化蛋白的浓度 | 第15页 |
| ·纯化蛋白鉴定 | 第15-17页 |
| ·hTNFα蛋白的活性检测 | 第17-18页 |
| 三、实验结果 | 第18-22页 |
| ·PAYZ-hTNFα的诱导表达 | 第18页 |
| ·hTNF-α蛋白的纯化 | 第18-20页 |
| ·hTNF-α蛋白的定量 | 第20页 |
| ·表达的hTNF蛋白的生物学活性 | 第20-22页 |
| 第二部分 单克隆抗体的制备及其活性检测 | 第22-50页 |
| 一.实验材料 | 第24-25页 |
| ·细胞系与细胞培养 | 第24页 |
| ·实验动物 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24-25页 |
| ·仪器 | 第25页 |
| 二.实验方法 | 第25-36页 |
| ·基础免疫动物 | 第25页 |
| ·ELISA方法测定血清效价 | 第25-26页 |
| ·加强免疫 | 第26页 |
| ·融合前准备 | 第26-27页 |
| ·杂交瘤细胞的培养 | 第26页 |
| ·饲养细胞的制备 | 第26-27页 |
| ·细胞融合 | 第27-28页 |
| ·免疫脾细胞悬液的制备 | 第27页 |
| ·细胞融合 | 第27-28页 |
| ·杂交瘤抗体检测及阳性克隆筛选 | 第28-29页 |
| ·杂交瘤的克隆化和冻存 | 第29-30页 |
| ·腹腔巨噬细胞细胞滋养层的制备 | 第29-30页 |
| ·有限稀释法克隆化 | 第30页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存 | 第30页 |
| ·腹水型单克隆抗体制备 | 第30-33页 |
| ·小鼠预处理 | 第30页 |
| ·接种杂交瘤细胞 | 第30页 |
| ·采集腹水 | 第30-31页 |
| ·单克隆抗体纯化 | 第31-33页 |
| ·饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体 | 第31-32页 |
| ·蛋白G亲和层析纯化腹水 | 第32-33页 |
| ·测定单抗质量浓度 | 第33页 |
| ·SDS-PAGE电泳检验抗体纯度 | 第33页 |
| ·单克隆抗体特性的检测 | 第33-36页 |
| ·单克隆抗体亚型的鉴定 | 第33-34页 |
| ·鉴定单克隆抗体结合抗原的特异性 | 第34页 |
| ·鉴定单克隆抗体与细胞表面抗原的结合活性 | 第34页 |
| ·测定单克隆抗体与抗原的亲和力 | 第34-35页 |
| ·抗TNFα单克隆抗体对hTNF-α介导的L929细胞凋亡的抑制作用 | 第35-36页 |
| ·单克隆抗体抑制量子点(EviTag Quantum Dots)标记hTNF-α结合受体实验 | 第36页 |
| 三.实验结果 | 第36-50页 |
| ·分泌抗hTNFα的杂交瘤细胞株的建立 | 第36-43页 |
| ·腹水的纯化 | 第43页 |
| ·腹水抗体纯化后蛋白浓度的测定及SDA-PAGE凝胶电泳分析 | 第43-44页 |
| ·单克隆抗体亚型的鉴定 | 第44页 |
| ·单克隆抗体结合抗原的特异性 | 第44页 |
| ·单克隆抗体与抗原的亲和常数 | 第44页 |
| ·抗hTNF-α单抗XB10特异性抑制hTNF-α介导的细胞毒作用 | 第44-45页 |
| ·抗hTNF-α单克隆抗体特异性结合实验 | 第45-48页 |
| ·XB10单抗抑制hTNFα诱导的L929细胞凋亡作用 | 第48页 |
| ·单克隆抗体抑制量子点(EviTag Quantum Dots)标记hTNF-α结合受体实验 | 第48-50页 |
| 第三部分 抗hTNF-α单克隆抗体基因的克隆 | 第50-67页 |
| 一、实验材料 | 第50页 |
| ·细胞 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| 二、实验方法 | 第50-55页 |
| ·RT-PCR方法克隆抗hTNFα抗体的轻、重链基因 | 第50-53页 |
| ·引物的设计与合成 | 第50-51页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第51页 |
| ·逆转录 | 第51-52页 |
| ·抗体轻、重链基因的扩增 | 第52-53页 |
| ·DNA片段的回收及鉴定 | 第53页 |
| ·胶回收 | 第53页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第53页 |
| ·连接、转化及鉴定 | 第53-54页 |
| ·连接反应 | 第54页 |
| ·连接后鉴定 | 第54页 |
| ·序列测定及分析 | 第54-55页 |
| ·序列测定 | 第54页 |
| ·氨基酸序列分析 | 第54-55页 |
| 三、实验结果 | 第55-59页 |
| ·抗hTNFα抗体的轻、重链基因的克隆 | 第55-56页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第56-58页 |
| ·测序结果 | 第58-59页 |
| 讨论 | 第59-63页 |
| 结论 | 第63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 附录一 | 第67-70页 |
| 英文缩略词汇表 | 第67-70页 |
| 附录二 | 第70-75页 |
| 溶液配制 | 第70-75页 |
| 综述 | 第75-92页 |
| 肿瘤坏死因子-α及抗肿瘤坏死因子-α治疗 | 第75-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 附录 | 第93-94页 |
