| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4-5页 |
| 前言 | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-27页 |
| 1.1 基因工程方法表达羧肽酶 | 第11-15页 |
| 1.1.1 基因工程研究进展 | 第11-13页 |
| 1.1.2 毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| 1.1.3 羧肽酶的研究及应用 | 第14-15页 |
| 1.2 生物活性肽的研究进展 | 第15-20页 |
| 1.2.1 降血压肽 | 第16-17页 |
| 1.2.2 抗氧化肽 | 第17-18页 |
| 1.2.3 抗菌肽 | 第18-19页 |
| 1.2.4 免疫活性肽 | 第19-20页 |
| 1.3 多肽合成的研究进展 | 第20-25页 |
| 1.3.1 酶法合成多肽 | 第21-23页 |
| 1.3.2 多肽固相合成法 | 第23-25页 |
| 1.4 本课题主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 米曲霉羧肽酶Y的克隆及表达 | 第27-51页 |
| 2.1 引言 | 第27-28页 |
| 2.2 材料与方法 | 第28-32页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第28页 |
| 2.2.2 酶与主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第29页 |
| 2.2.4 培养基与常用溶液的配制 | 第29-30页 |
| 2.2.5 引物设计及基因克隆 | 第30-32页 |
| 2.3 实验方法 | 第32-42页 |
| 2.3.1 米曲霉菌种培养及基因组提取 | 第32页 |
| 2.3.2 米曲霉羧肽酶Y基因的克隆扩增 | 第32-33页 |
| 2.3.3 米曲霉羧肽酶Y基因PCR产物的胶回收 | 第33页 |
| 2.3.4 米曲霉羧肽酶Y基因去信号肽及内含子 | 第33-34页 |
| 2.3.5 载体质粒的构建与转化 | 第34页 |
| 2.3.6 重组载体转入DH5α感受态细胞及鉴定 | 第34-35页 |
| 2.3.7 CPY-pPIC9 重组质粒的构建 | 第35页 |
| 2.3.8 重组质粒转化入毕赤酵母及阳性转化子的鉴定 | 第35-37页 |
| 2.3.9 重组米曲霉羧肽酶Y(CPY)的诱导表达 | 第37-38页 |
| 2.3.10 重组米曲霉羧肽酶Y的分离纯化 | 第38页 |
| 2.3.11 蛋白浓度的测定 | 第38-39页 |
| 2.3.12 重组米曲霉羧肽酶Y酶活的测定 | 第39页 |
| 2.3.13 蛋白SDS-PAGE检测 | 第39-41页 |
| 2.3.14 重组酵母菌株的摇瓶优化 | 第41-42页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第42-48页 |
| 2.4.1 CPY-pET28a载体质粒的构建 | 第42页 |
| 2.4.2 CPY-pPIC9 重组质粒的构建 | 第42-43页 |
| 2.4.3 重组米曲霉羧肽酶Y在毕赤酵母GS115 中的诱导表达 | 第43-44页 |
| 2.4.4 毕赤酵母的生长曲线 | 第44-45页 |
| 2.4.5 重组米曲霉羧肽酶Y酶活及蛋白含量的测定 | 第45-46页 |
| 2.4.6 重组毕赤酵母的摇瓶优化 | 第46-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-51页 |
| 第三章 液相体系下羧肽酶催化合成二肽前体BOC-Tyr-Ala | 第51-67页 |
| 3.1 引言 | 第51-52页 |
| 3.2 实验材料和方法 | 第52-53页 |
| 3.2.1 实验材料与仪器 | 第52页 |
| 3.2.2 抗氧化二肽前体BOC-Tyr-Ala的酶促合成 | 第52页 |
| 3.2.3 反应体系的RP-HPLC分析 | 第52-53页 |
| 3.2.4 反应物及产物的RP-HPLC-MS鉴定 | 第53页 |
| 3.2.5 反应物与产物标准曲线的绘制及收率计算 | 第53页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第53-65页 |
| 3.3.1 羧肽酶催化合成二肽的反应原理 | 第54页 |
| 3.3.2 液相色谱的条件优化 | 第54页 |
| 3.3.3 液质联用的分析结果 | 第54-55页 |
| 3.3.4 标准曲线的测定 | 第55-56页 |
| 3.3.5 反应条件对BOC-Tyr-Ala收率的影响 | 第56-61页 |
| 3.3.6 反应机理及动力学模型 | 第61-65页 |
| 3.4 本章小结 | 第65-67页 |
| 第四章 固相酶法合成活性抗氧化二肽Tyr-Ala | 第67-79页 |
| 4.1 引言 | 第67-68页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第68-71页 |
| 4.2.1 实验材料与仪器 | 第68-69页 |
| 4.2.2 酪氨酸与王氏树脂的连接 | 第69页 |
| 4.2.3 测定树脂的连接效率 | 第69页 |
| 4.2.4 BOC-Tyr(Wang resin)-Ala的酶促合成 | 第69页 |
| 4.2.5 树脂的切割及产物检测 | 第69-70页 |
| 4.2.6 产品的抗氧化性能测定 | 第70-71页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第71-77页 |
| 4.3.1 酪氨酸与树脂的连接效率 | 第71-73页 |
| 4.3.2 反应产物的HPLC以及HPLC-MS鉴定 | 第73-74页 |
| 4.3.3 固相酶法合成二肽条件的优化 | 第74-76页 |
| 4.3.4 产物Tyr-Ala抗氧化能力的检测 | 第76-77页 |
| 4.4 本章小结 | 第77-79页 |
| 第五章 结论与展望 | 第79-81页 |
| 5.1 结论 | 第79-80页 |
| 5.2 主要创新点 | 第80页 |
| 5.3 展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-93页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第93-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
