| 中文摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 前言 | 第11-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-27页 |
| 1.1 心血管疾病简介及现状 | 第13页 |
| 1.2 抗凝剂 | 第13-14页 |
| 1.3 水蛭素 | 第14-18页 |
| 1.3.1 水蛭素的结构和功能 | 第14-15页 |
| 1.3.2 凝血酶的结构及功能 | 第15页 |
| 1.3.3 水蛭素的临床应用及前景 | 第15-16页 |
| 1.3.4 新蛭素 | 第16-18页 |
| 1.4 延长生物药物半衰期的策略 | 第18-23页 |
| 1.4.1 PEG修饰蛋白药物策略 | 第18-19页 |
| 1.4.2 XTEN和PAS融合策略 | 第19-20页 |
| 1.4.3 糖基化修饰策略 | 第20页 |
| 1.4.4 Fc融合蛋白策略 | 第20-23页 |
| 1.4.4.1 新生儿Fc受体 | 第21页 |
| 1.4.4.2 FcRn与IgG的相互作用 | 第21-22页 |
| 1.4.4.3 FcRn延长半衰期的原理 | 第22页 |
| 1.4.4.4 降低IgG介导的细胞毒作用 | 第22-23页 |
| 1.5 抗凝剂药效学检测方法 | 第23-24页 |
| 1.5.1 体外抗凝 | 第23-24页 |
| 1.5.2 体内抗凝 | 第24页 |
| 1.6 抗凝剂药代动力学的初步研究 | 第24-26页 |
| 1.7 本文研究内容 | 第26-27页 |
| 第2章 融合蛋白IgG4-Fc-EH和IgG4-Fc-L-EH的制备与鉴定 | 第27-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 质粒和细胞 | 第27页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第28页 |
| 2.1.4 实验试剂配制 | 第28-30页 |
| 2.1.5 实验用序列 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-44页 |
| 2.2.1 pGEM-T-Fc-EH和pGEM-T-Fc-L-EH质粒的构建与鉴定 | 第30-35页 |
| 2.2.1.1 目的基因扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.1.2 凝胶回收DNA片段 | 第31页 |
| 2.2.1.3 胶回收产物的PCR反应 | 第31-32页 |
| 2.2.1.4 连接转化 | 第32-33页 |
| 2.2.1.5 pGEM-T-Fc-EH和pGEM-T-Fc-L-EH质粒鉴定 | 第33-35页 |
| 2.2.2 重组表达载体的构建与鉴定 | 第35-37页 |
| 2.2.3 重组质粒转染CHO细胞 | 第37-38页 |
| 2.2.3.1 CHO细胞复苏和培养 | 第37页 |
| 2.2.3.2 细胞计数和铺培养瓶 | 第37页 |
| 2.2.3.3 重组质粒转染CHO细胞和加压筛选 | 第37-38页 |
| 2.2.4 融合蛋白高表达细胞株的筛选和Western Blot验证 | 第38-41页 |
| 2.2.4.1 高表达细胞株的筛选 | 第38页 |
| 2.2.4.2 ELISA法检测融合蛋白表达水平 | 第38-39页 |
| 2.2.4.3 融合蛋白的Western Blot检测 | 第39-41页 |
| 2.2.5 融合蛋白的表达纯化 | 第41-42页 |
| 2.2.5.1 细胞株的扩大培养 | 第41页 |
| 2.2.5.2 细胞培养上清的收集 | 第41页 |
| 2.2.5.3 Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白 | 第41-42页 |
| 2.2.6 纯化蛋白的浓度和纯度检测 | 第42-43页 |
| 2.2.6.1 纯化蛋白的浓度 | 第42-43页 |
| 2.2.6.2 纯化蛋白的纯度 | 第43页 |
| 2.2.7 融合蛋白分子量和序列测定 | 第43-44页 |
| 2.2.7.1 融合蛋白分子量的测定 | 第43页 |
| 2.2.7.2 融合蛋白序列测定 | 第43-44页 |
| 2.3 结果 | 第44-52页 |
| 2.3.1 Fc-EH和Fc-L-EH目的基因的优化合成 | 第44-45页 |
| 2.3.2 Fc-EH和Fc-L-EH基因的PCR扩增 | 第45-46页 |
| 2.3.3 pGEM-T-Fc-EH和pGEM-T-Fc-L-EH重组质粒的构建 | 第46-47页 |
| 2.3.4 pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH重组质粒的构建 | 第47页 |
| 2.3.5 重组质粒转染和阳性克隆的筛选 | 第47-48页 |
| 2.3.6 融合蛋白的Western Blot验证 | 第48页 |
| 2.3.7 Protein A亲和柱纯化融合蛋白 | 第48-49页 |
| 2.3.8 融合蛋白的鉴定 | 第49-52页 |
| 2.3.8.1 融合蛋白的SDS-PAGE鉴定 | 第49-50页 |
| 2.3.8.2 融合蛋白的质谱检测结果 | 第50页 |
| 2.3.8.3 融合蛋白的测序结果 | 第50-52页 |
| 2.4 讨论 | 第52-55页 |
| 第3章 融合蛋白Fc-EH活性检测和体内药代动力学初步研究 | 第55-65页 |
| 3.1 实验材料 | 第55-56页 |
| 3.1.1 实验动物 | 第55页 |
| 3.1.2 实验试剂 | 第55-56页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第56页 |
| 3.1.4 实验试剂组成及配制 | 第56页 |
| 3.2 实验方法 | 第56-58页 |
| 3.2.1 融合蛋白体外活性检测 | 第56-57页 |
| 3.2.1.1 蛋白抗凝活性的测定 | 第56-57页 |
| 3.2.1.2 融合蛋白活性的定义和计算 | 第57页 |
| 3.2.2 融合蛋白体内活性的初步检测 | 第57-58页 |
| 3.2.3 融合蛋白Fc-EH药代动力学的初步研究 | 第58页 |
| 3.3 结果 | 第58-62页 |
| 3.3.1 融合蛋白倍比稀释抗凝活性测定结果 | 第58-59页 |
| 3.3.2 抗大鼠颈静脉血栓结果 | 第59-60页 |
| 3.3.3 融合蛋白Fc-EH药代动力学初步研究 | 第60-62页 |
| 3.3.3.1 标准曲线和定量限 | 第60-61页 |
| 3.3.3.2 融合蛋白Fc-EH药代动力学初步检测结果 | 第61-62页 |
| 3.4 讨论 | 第62-65页 |
| 第4章 总结 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 发表论文和参加科研情况 | 第73-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
