| 符号说明 | 第5-13页 |
| 中文摘要 | 第13-16页 |
| 英文摘要 | 第16-19页 |
| 1 前言 | 第20-40页 |
| 1.1 有机磷农药残留现状及其危害 | 第20-24页 |
| 1.1.1 有机磷农药概述 | 第20-21页 |
| 1.1.2 有机磷农药残留现状 | 第21-22页 |
| 1.1.3 有机磷农药残留危害 | 第22-24页 |
| 1.2 有机磷农药残留检测技术应用现状 | 第24-28页 |
| 1.2.1 仪器分析法 | 第24-25页 |
| 1.2.1.1 气相色谱法(GC) | 第24-25页 |
| 1.2.1.2 高效液相色谱法(HPLC) | 第25页 |
| 1.2.2 酶抑制法 | 第25-27页 |
| 1.2.3 免疫分析法 | 第27-28页 |
| 1.3 有机磷农药多残留酶联免疫分析技术的国内外研究进展 | 第28-31页 |
| 1.3.1 通过制备宽谱特异性抗体进行农药多残留免疫分析 | 第28-30页 |
| 1.3.1.1 通用结构半抗原的合成 | 第28-30页 |
| 1.3.1.2 多决定簇人工抗原制备 | 第30页 |
| 1.3.2 通过使用混合抗体进行农药多残留免疫分析 | 第30页 |
| 1.3.3 通过制备重组抗体或单链抗体进行农药多残留检测 | 第30-31页 |
| 1.4 噬菌体展示技术及其在小分子化合物检测中的应用 | 第31-37页 |
| 1.4.1 噬菌体展示技术的原理 | 第31-33页 |
| 1.4.2 噬菌体展示技术载体系统 | 第33-34页 |
| 1.4.2.1 单链噬菌体展示系统 | 第33页 |
| 1.4.2.2 T4噬菌体展示系统 | 第33页 |
| 1.4.2.3 λ噬菌体展示系统 | 第33-34页 |
| 1.4.3 噬菌体展示技术在小分子化合物免疫检测中的应用 | 第34-37页 |
| 1.4.3.1 筛选小分子抗体 | 第34-36页 |
| 1.4.3.2 筛选农药小分子的肽模拟物 | 第36-37页 |
| 1.5 本研究的目的及其意义 | 第37-38页 |
| 1.6 研究内容 | 第38-39页 |
| 1.7 技术路线 | 第39-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-62页 |
| 2.1 材料 | 第40-42页 |
| 2.1.1 噬菌体展示肽库及宿主菌 | 第40页 |
| 2.1.2 培养基和缓冲溶液 | 第40-41页 |
| 2.1.3 各种生化试剂 | 第41页 |
| 2.1.4 实验动物 | 第41页 |
| 2.1.5 主要仪器与设备 | 第41-42页 |
| 2.2 方法 | 第42-62页 |
| 2.2.1 有机磷农药通用结构半抗原的合成与鉴定 | 第42-44页 |
| 2.2.1.1 芳香基二甲氧基硫代磷酸酯类农药通用结构半抗原(PM)的合成 | 第42-43页 |
| 2.2.1.2 芳香基二乙氧基磷酸酯类农药通用结构半抗原(PO)的合成 | 第43页 |
| 2.2.1.3 直链二甲氧基硫代磷酸酯类农药通用结构半抗原(PS)的合成 | 第43页 |
| 2.2.1.4 农药通用半抗原的鉴定 | 第43-44页 |
| 2.2.2 半抗原一载体蛋白偶联物(单簇人工抗原)的合成与鉴定 | 第44-46页 |
| 2.2.2.1 芳香基二甲氧基硫代磷酸酯类农药单簇人工抗原的合成 | 第44页 |
| 2.2.2.2 芳香基二乙氧基磷酸酯类农药单簇人工抗原的合成 | 第44页 |
| 2.2.2.3 直链二甲氧基硫代磷酸酯类农药单簇人工抗原的合成 | 第44-45页 |
| 2.2.2.4 直链二乙氧基磷酸酯类农药单簇人工抗原的合成 | 第45页 |
| 2.2.2.5 有机磷通用结构人工抗原偶联情况的分析 | 第45页 |
| 2.2.2.6 人工抗原偶联比的测定 | 第45-46页 |
| 2.2.3 双簇通用结构人工抗原的合成 | 第46-48页 |
| 2.2.3.1 PM-DPA-BSA免疫原和DPA-PM-OVA包被原的合成 | 第46-47页 |
| 2.2.3.2 PS-DPA-BSA免疫原和PS-DPA-OVA包被原的合成 | 第47页 |
| 2.2.3.3 PM-PO-BSA免疫原和PM-PO-OVA的合成 | 第47-48页 |
| 2.2.3.4 PO-PS-BSA免疫原和PO-PS-OVA包被原的合成 | 第48页 |
| 2.2.4 兔宽谱特异性多克隆抗体的制备 | 第48-50页 |
| 2.2.4.1 抗血清的制备 | 第48-49页 |
| 2.2.4.2 兔血清效价检测 | 第49页 |
| 2.2.4.3 兔多克隆抗体的纯化 | 第49-50页 |
| 2.2.5 鼠多克隆抗体的制备 | 第50-51页 |
| 2.2.5.1 BALB/c小鼠免疫过程（田园，2012) | 第50-51页 |
| 2.2.5.2 小鼠血清效价检测 | 第51页 |
| 2.2.5.3 小鼠多克隆抗体的纯化 | 第51页 |
| 2.2.6 单克隆抗体的制备（田园，2012) | 第51-52页 |
| 2.2.6.1 有机磷农药杂交瘤细胞的制备与筛选 | 第51页 |
| 2.2.6.2 杂交瘤细胞的单克隆化 | 第51-52页 |
| 2.2.6.3 单克隆抗体的大量制备 | 第52页 |
| 2.2.7 ELISA方法的优化和建立 | 第52-54页 |
| 2.2.7.1 抗原抗体最适工作浓度的选择 | 第52-53页 |
| 2.2.7.2 包被原最适浓度的选择 | 第53页 |
| 2.2.7.3 有机溶剂含量对ELISA检测的影响 | 第53页 |
| 2.2.7.4 竞争反应体系pH值对ELISA检测的影响 | 第53-54页 |
| 2.2.7.5 离子强度对ELISA检测的影响 | 第54页 |
| 2.2.7.6 宽谱抗体亲和性及检测灵敏度——标准曲线的建立 | 第54页 |
| 2.2.7.7 宽谱抗体的特异性交叉实验 | 第54页 |
| 2.2.7.8 样本添加回收试验 | 第54页 |
| 2.2.8 噬菌体展示肽库筛选农药通用结构半抗原的肽模拟物 | 第54-62页 |
| 2.2.8.1 宿主菌E.coli ER2738生长曲线的测定 | 第54-55页 |
| 2.2.8.2 特异性结合噬菌体的生物淘洗 | 第55-58页 |
| 2.2.8.3 间接ELISA法检测阳性噬菌体克隆 | 第58-59页 |
| 2.2.8.4 阳性噬菌体与抗体的工作浓度优化 | 第59页 |
| 2.2.8.5 间接竞争ELISA法检测噬菌体阳性克隆特异性 | 第59-60页 |
| 2.2.8.6 阳性噬菌体克隆DNA模板的快速纯化、测序 | 第60-61页 |
| 2.2.8.7 PO-PS-Phage-ELISA检测方法的建立 | 第61-62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-138页 |
| 3.1 有机磷农药通用结构半抗原的鉴定 | 第62-65页 |
| 3.1.1 紫外吸收光谱法分析结果 | 第62-63页 |
| 3.1.2 半抗原分子的核磁共振鉴定 | 第63-65页 |
| 3.1.2.1 芳香基二甲氧基硫代磷酸酯类农药通用半抗原(PM)的结构鉴定 | 第63页 |
| 3.1.2.2 芳香基二乙氧基磷酸酯类农药通用半抗原(PO)的结构鉴定 | 第63-64页 |
| 3.1.2.3 直链二甲氧基硫代磷酸酯类农药通用半抗原(PS)的结构鉴定 | 第64-65页 |
| 3.2 单簇通用结构人工抗原的鉴定 | 第65-70页 |
| 3.2.1 芳香基二甲氧基硫代磷酸酯类农药通用人工抗原的鉴定 | 第65-66页 |
| 3.2.2 芳香基二乙氧基磷酸酯类农药通用人工抗原的鉴定 | 第66-68页 |
| 3.2.3 直链二甲氧基硫代磷酸酯类农药通用人工抗原的鉴定 | 第68-69页 |
| 3.2.4 直链二乙氧基磷酸酯类农药通用人工抗原的鉴定 | 第69-70页 |
| 3.3 单簇通用人工抗原偶联比的计算 | 第70-73页 |
| 3.3.1 半抗原标准曲线的绘制 | 第70-71页 |
| 3.3.2 载体蛋白BSA标准曲线的绘制 | 第71页 |
| 3.3.3 载体蛋白OVA标准曲线的绘制 | 第71-72页 |
| 3.3.4 人工抗原吸收波长的测定 | 第72-73页 |
| 3.3.5 偶联比率的计算 | 第73页 |
| 3.4 双簇通用人工抗原的鉴定及偶联比计算 | 第73-77页 |
| 3.4.1 PM-DPA-BSA和DPA-PM-OVA偶联比计算 | 第73-74页 |
| 3.4.2 PS-DPA-BSA和PS-DPA-OVA偶联比计算 | 第74-75页 |
| 3.4.3 PM-PO-BSA和PM-PO-OVA偶联比计算 | 第75-76页 |
| 3.4.4 PO-PS-BSA和PO-PS-OVA偶联比计算 | 第76-77页 |
| 3.5 兔宽谱多克隆抗体的制备及ELISA方法的建立 | 第77-113页 |
| 3.5.1 兔宽谱多克隆抗血清的效价测定 | 第77-82页 |
| 3.5.1.1 抗PM-DPA血清的效价测定 | 第78-79页 |
| 3.5.1.2 抗PS-DPA血清的效价测定 | 第79-80页 |
| 3.5.1.3 抗PM-PO血清的效价测定 | 第80页 |
| 3.5.1.4 抗PO-PS血清的效价测定 | 第80-82页 |
| 3.5.2 抗体纯化方法的确定 | 第82-85页 |
| 3.5.3 纯化后的多克隆抗体效价及亲合性检测 | 第85-87页 |
| 3.5.4 抗原-宽谱多抗最适工作浓度的优化 | 第87-91页 |
| 3.5.5 兔宽谱多克隆抗体的筛选 | 第91-93页 |
| 3.5.6 以PAb PM-PO为抗体的ELISA方法的建立 | 第93-104页 |
| 3.5.6.1 不同包被原及包被原浓度对ELISA检测灵敏度的影响 | 第93-94页 |
| 3.5.6.2 有机溶剂对ELISA检测灵敏度的影响 | 第94-95页 |
| 3.5.6.3 pH对ELISA检测灵敏度的影响 | 第95-96页 |
| 3.5.6.4 离子浓度对ELISA检测灵敏度的影响 | 第96页 |
| 3.5.6.5 竞争时间对ELISA检测灵敏度的影响 | 第96-97页 |
| 3.5.6.6 标准曲线的建立 | 第97-98页 |
| 3.5.6.7 交叉实验 | 第98-102页 |
| 3.5.6.8 样品添加回收率试验 | 第102-104页 |
| 3.5.7 以PAb PO-PS为抗体的ELISA方法的建立 | 第104-113页 |
| 3.5.7.1 不同包被原及包被原浓度对ELISA检测灵敏度的影响 | 第104-105页 |
| 3.5.7.2 有机溶剂对ELISA检测灵敏度的影响 | 第105-106页 |
| 3.5.7.3 pH对ELISA检测灵敏度的影响 | 第106页 |
| 3.5.7.4 磷酸离子对ELISA检测灵敏度的影响 | 第106-107页 |
| 3.5.7.5 标准曲线的建立 | 第107-108页 |
| 3.5.7.6 交叉反应 | 第108-111页 |
| 3.5.7.7 样品添加回收率试验 | 第111-113页 |
| 3.6 鼠宽谱单克隆抗体的制备及ELISA方法的建立 | 第113-124页 |
| 3.6.1 鼠宽谱多克隆抗血清的效价测定 | 第113-117页 |
| 3.6.1.1 抗PM-DPA血清的效价测定 | 第113-114页 |
| 3.6.1.2 抗PS-DPA血清的效价测定 | 第114-115页 |
| 3.6.1.3 抗PM-PO血清的效价测定 | 第115-116页 |
| 3.6.1.4 抗PO-PS血清的效价测定 | 第116-117页 |
| 3.6.2 细胞的融合及筛选 | 第117-119页 |
| 3.6.3 单克隆抗体效价的测定与纯化 | 第119页 |
| 3.6.4 以MAb PO-PS为抗体的ELISA方法的建立 | 第119-124页 |
| 3.6.4.1 抗原与抗体工作浓度的优化 | 第119-120页 |
| 3.6.4.2 标准曲线的建立 | 第120-121页 |
| 3.6.4.3 交叉反应 | 第121-124页 |
| 3.6.4.4 样品添加回收率试验 | 第124页 |
| 3.7 从噬菌体展示肽库中淘选农药通用结构模拟肽 | 第124-138页 |
| 3.7.1 以PAb PO-PS为靶标从噬菌体肽库中淘选农药通用半抗原的肽模拟物 | 第124-132页 |
| 3.7.1.1 E.coli ER2738生长曲线测定 | 第125页 |
| 3.7.1.2 噬菌体肽库亲和淘选结果 | 第125-126页 |
| 3.7.1.3 ELISA检测阳性噬菌斑克隆结果 | 第126-128页 |
| 3.7.1.4 竞争ELISA检测阳性噬菌斑克隆结果 | 第128页 |
| 3.7.1.5 噬菌体DNA的提取、测序 | 第128-130页 |
| 3.7.1.6 Phage-ELISA检测方法标准曲线的建立 | 第130-131页 |
| 3.7.1.7 交叉反应 | 第131-132页 |
| 3.7.1.8 样品加标回收实验结果 | 第132页 |
| 3.7.2 以MAbPO-PS为靶标从噬菌体展示肽库中淘选农药通用结构模拟肽 | 第132-138页 |
| 3.7.2.1 噬菌体十二肽库的亲和淘选结果 | 第132-133页 |
| 3.7.2.2 ELISA检测阳性噬菌斑克隆结果 | 第133页 |
| 3.7.2.3 竞争ELISA检测阳性噬菌斑克隆结果 | 第133-134页 |
| 3.7.2.4 噬菌体DNA的提取、测序 | 第134-135页 |
| 3.7.2.5 Phage-ELISA检测方法标准曲线的建立 | 第135页 |
| 3.7.2.6 交叉反应 | 第135-136页 |
| 3.7.2.7 样品加标回收试验结果 | 第136-138页 |
| 4 讨论 | 第138-146页 |
| 4.1 有机磷农药半抗原的设计与合成 | 第138-139页 |
| 4.2 载体蛋白及偶联方法的选择 | 第139-141页 |
| 4.2.1 载体蛋白的选择 | 第139-140页 |
| 4.2.2 偶联方法的选择 | 第140-141页 |
| 4.3 人工抗原偶联物的鉴定和偶联率的测定 | 第141-142页 |
| 4.4 有机磷农药宽谱抗体的制备 | 第142-143页 |
| 4.5 有机磷农药多残留免疫检测方法的建立 | 第143-144页 |
| 4.6 基于噬菌体展示技术的异源检测方法的建立 | 第144-146页 |
| 4.6.1 噬菌体亲和筛选影响因素 | 第144-145页 |
| 4.6.1.1 靶分子的纯度 | 第144页 |
| 4.6.1.2 肽库的选择 | 第144-145页 |
| 4.6.1.3 去污剂及靶分子的浓度 | 第145页 |
| 4.6.1.4 结合时间和洗脱时间 | 第145页 |
| 4.6.2 Phage-ELISA异源检测方法的建立 | 第145-146页 |
| 5 结论 | 第146-147页 |
| 参考文献 | 第147-154页 |
| 致谢 | 第154-155页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第155页 |
