| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 前言 | 第13-21页 |
| 1. 研究背景 | 第13-18页 |
| 1.1 糖尿病及糖尿病肾病 | 第13-14页 |
| 1.2 氧化应激增强是影响2型糖尿病及糖尿病肾病发生发展的主要因素 | 第14-15页 |
| 1.3 RNA氧化损伤是一种新的致病机制 | 第15-18页 |
| 2. 国内外研究现状 | 第18-20页 |
| 3. 研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 第一部分 高血糖时RNA氧化损伤的评估 | 第21-42页 |
| 1. 材料 | 第21-24页 |
| 1.1 实验动物 | 第21页 |
| 1.2 主要仪器 | 第21-22页 |
| 1.3 主要试剂 | 第22-24页 |
| 2. 方法 | 第24-34页 |
| 2.1 动物放置及样本采集 | 第24-25页 |
| 2.2 ID-LC-MS/MS检测各脏器8-oxo-dGsn的含量 | 第25-27页 |
| 2.3 ID-LC-MS/MS检测各脏器8-oxo-Gsn的含量 | 第27-30页 |
| 2.4 血浆8-oxo-dGsn与8-oxo-Gsn浓度的检测 | 第30-31页 |
| 2.5 尿液中8-oxo-dGsn和8-oxo-Gsn含量的检测 | 第31-33页 |
| 2.6 尿液肌酐的检测 | 第33-34页 |
| 3. 结果 | 第34-39页 |
| 3.1 动物模型的一般生理和生化特征 | 第34页 |
| 3.2 各脏器DNA中8-oxo-dGsn的含量 | 第34-36页 |
| 3.3 各脏器RNA中8-oxo-Gsn的含量 | 第36-37页 |
| 3.4 血浆中8-oxo-dGsn和8-oxo-Gsn的含量 | 第37-38页 |
| 3.5 尿液中8-oxo-dGsn和8-oxo-Gsn的含量 | 第38-39页 |
| 4. 讨论 | 第39-41页 |
| 5. 结论 | 第41-42页 |
| 第二部分 RNA氧化损伤是糖尿病肾病的早期表现 | 第42-66页 |
| 1. 材料 | 第42-45页 |
| 1.1 实验动物 | 第42-43页 |
| 1.2 主要仪器 | 第43-44页 |
| 1.3 主要试剂 | 第44-45页 |
| 2. 方法 | 第45-56页 |
| 2.1 动物放置及样本采集 | 第45-46页 |
| 2.2 血浆和尿液肾功能指标的测定 | 第46-47页 |
| 2.3 小鼠肾脏HE染色、PAS染色及电镜观察 | 第47-48页 |
| 2.4 肾脏8-oxo-dG免疫组化 | 第48-49页 |
| 2.5 肾脏8-oxoG免疫组化 | 第49-50页 |
| 2.6 肾脏8-oxo-dGsn的质谱检测 | 第50-52页 |
| 2.7 肾脏8-oxo-Gsn的质谱检测 | 第52-54页 |
| 2.8 尿8-oxo-dGsn和8-oxo-Gsn的质谱检测 | 第54-56页 |
| 3. 结果 | 第56-63页 |
| 3.1 小鼠一般生理和生化特征 | 第56-58页 |
| 3.2 肾组织8-oxo-dG和8-oxoG免疫组化 | 第58-59页 |
| 3.3 肾组织核酸氧化损伤的定量分析 | 第59-61页 |
| 3.4 尿液中氧化鸟苷含量的定量分析 | 第61页 |
| 3.5 肾脏组织和尿中8-oxodGsn/ 8-oxoGsn的关联分析 | 第61-62页 |
| 3.6 8-oxodGsn/8-oxoGsn与尿微量白蛋白的关联分析 | 第62-63页 |
| 4. 讨论 | 第63-65页 |
| 5. 结论 | 第65-66页 |
| 第三部分 胰岛素原变异多肽定量检测方法的建立 | 第66-77页 |
| 1. 材料 | 第67-68页 |
| 1.1 主要仪器 | 第67页 |
| 1.2 主要试剂 | 第67-68页 |
| 2. 方法 | 第68-70页 |
| 2.1 肽段标准品序列的获取 | 第68-69页 |
| 2.2 Agilent-6490-Triple-Quad-MS参数的建立 | 第69页 |
| 2.3 配制合适浓度的混标，优化离子源参数 | 第69页 |
| 2.4 色谱条件优化 | 第69页 |
| 2.5 利用Endoproteinase GluC酶酶切胰岛素原蛋白验证 | 第69页 |
| 2.6 数据处理 | 第69-70页 |
| 3. 结果 | 第70-74页 |
| 3.1 质谱参数的确定结果 | 第70-73页 |
| 3.2 优化后的质谱离子源参数 | 第73页 |
| 3.3 优化后的液相条件 | 第73页 |
| 3.4 肽段分离结果 | 第73-74页 |
| 3.5 胰岛素原Endoproteinase GluC酶切验证结果 | 第74页 |
| 3.6 检测敏感度 | 第74页 |
| 4. 讨论 | 第74-76页 |
| 5. 结论 | 第76-77页 |
| 第四部分 胰岛素原及其变异蛋白真核表达细胞株的构建 | 第77-99页 |
| 1. 材料 | 第77-80页 |
| 1.1 细胞株 | 第77-78页 |
| 1.2 主要仪器 | 第78页 |
| 1.3 主要试剂 | 第78-80页 |
| 2. 方法 | 第80-92页 |
| 2.1 INS -PCMV-SPORT6重组质粒的鉴定 | 第80-81页 |
| 2.2 胰岛素原基因定点诱变及其T载体的构建 | 第81-85页 |
| 2.3 pLVX-IRES-Hyg-Insulin载体构建 | 第85-87页 |
| 2.4 HEK293细胞的培养及病毒的包装 | 第87-88页 |
| 2.5 AtT-20/D16v-F2细胞培养 | 第88页 |
| 2.6 AtT-20/D16v-F2细胞潮霉素最佳浓度的筛选 | 第88页 |
| 2.7 病毒颗粒侵染AtT-20/D16v-F2细胞 | 第88-89页 |
| 2.8 细胞株胰岛素原western-blot检测 | 第89-90页 |
| 2.9 细胞株胰岛素原实时定量PCR检测 | 第90-92页 |
| 3. 结果 | 第92-96页 |
| 3.1 INS-PCMV-SPORT6重组质粒的鉴定 | 第92-93页 |
| 3.2 胰岛素原基因定点诱变 | 第93页 |
| 3.3 pLVX-IRES-Hyg-pronsμlin的构建 | 第93-95页 |
| 3.4 细胞株胰岛素原western blot检测 | 第95页 |
| 3.5 细胞株胰岛素原实时定量PCR检测 | 第95-96页 |
| 4. 讨论 | 第96-98页 |
| 5. 结论 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 附录 | 第109-127页 |
| Ⅰ 英文缩略词表 | 第109-113页 |
| Ⅱ 文献综述 | 第113-125页 |
| 参考文献 | 第120-125页 |
| Ⅲ 已发表和待发表文章 | 第125-126页 |
| Ⅳ 参加学术会议 | 第126-127页 |
| Ⅴ 个人简历 | 第127页 |
