| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-19页 |
| 1 引言 | 第12页 |
| 2 干扰素γ | 第12-16页 |
| 2.1 干扰素的分类 | 第12-13页 |
| 2.2 干扰素γ的分子结构和理化性质 | 第13-14页 |
| 2.3 干扰素γ的生物活性 | 第14-15页 |
| 2.4 IFN-γ多肽的获取途径 | 第15页 |
| 2.5 关于干扰素-γ的检测方法 | 第15-16页 |
| 3 基因工程抗体 | 第16-18页 |
| 3.1 单链抗体的研究进展 | 第16-17页 |
| 3.2 单链抗体的噬菌体展示系统 | 第17-18页 |
| 4 本课题的研究目的及意义 | 第18-19页 |
| 第二章 IFN-γ抗原的制备与鉴定 | 第19-31页 |
| 1 引言 | 第19页 |
| 2 实验材料 | 第19-20页 |
| 2.1 主要质粒与菌株 | 第19页 |
| 2.2 所用仪器 | 第19-20页 |
| 2.3 主要材料和试剂 | 第20页 |
| 3 实验方法 | 第20-24页 |
| 3.1 引物设计 | 第20页 |
| 3.2 IFN-γ抗原基因的扩增及验证 | 第20-21页 |
| 3.3 表达载体pET28a-ifn-γ的构建 | 第21页 |
| 3.4 pET28a-ifn-γ的可溶性表达与纯化 | 第21-22页 |
| 3.5 纯化蛋白浓度测定 | 第22页 |
| 3.6 小鼠免疫 | 第22-24页 |
| 4 结果 | 第24-29页 |
| 4.1 人源IFN-γ全长基因的PCR扩增与质粒提取 | 第24-25页 |
| 4.2 重组抗原表达载体pET28a-ifn-γ的构建 | 第25页 |
| 4.3 重组抗原表达载体pET28a-ifn-γ的验证 | 第25-26页 |
| 4.4 重组抗原的表达与纯化 | 第26-27页 |
| 4.5 重组抗原蛋白浓度的测定 | 第27页 |
| 4.6 免疫小鼠效价测定 | 第27-29页 |
| 5 讨论 | 第29-30页 |
| 5.1 ifn-γ基因序列与氨基酸序列的获得 | 第29页 |
| 5.2 IFN-γ重组载体的构建 | 第29页 |
| 5.3 IFN-γ融合蛋白的表达与纯化 | 第29页 |
| 5.4 BCA测定蛋白浓度 | 第29-30页 |
| 5.5 小鼠免疫效果验证 | 第30页 |
| 6 结论 | 第30-31页 |
| 第三章 单链抗体噬菌体展示库的构建 | 第31-42页 |
| 1 引言 | 第31页 |
| 2 材料与方法 | 第31-37页 |
| 2.1 主要质粒和菌株 | 第31页 |
| 2.2 噬菌体建库的引物 | 第31-32页 |
| 2.3 主要材料和试剂 | 第32页 |
| 2.4 主要仪器 | 第32-33页 |
| 2.5 实验方法 | 第33-37页 |
| 2.5.1 小鼠脾脏细胞的分离 | 第33页 |
| 2.5.2 细胞总RNA的提取 | 第33页 |
| 2.5.3 细胞总RNA反转录 | 第33-34页 |
| 2.5.4 抗体轻、重链基因的扩增 | 第34页 |
| 2.5.5 scFv基因的组装与扩增 | 第34-35页 |
| 2.5.6 scFv重组载体的构建 | 第35页 |
| 2.5.7 建立噬菌体抗体库 | 第35-37页 |
| 3 实验结果分析 | 第37-40页 |
| 3.1 PCR扩增V_H,V_L和scFv | 第37页 |
| 3.2 插入载体的酶切 | 第37-38页 |
| 3.3 噬菌体抗体库容量的测定 | 第38-39页 |
| 3.4 噬菌体质粒目的片段插入率的测定 | 第39页 |
| 3.5 噬菌体抗体库多样性的测定 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-41页 |
| 4.1 高质量总RNA的制备 | 第40页 |
| 4.2 V_H-Linker-V_L与V_L-Linker-V_H的组装选择 | 第40页 |
| 4.3 噬菌体抗体库的构建 | 第40-41页 |
| 5 小结 | 第41-42页 |
| 第四章 单链抗体噬菌体展示库的淘选与可溶性表达 | 第42-53页 |
| 1 引言 | 第42页 |
| 2 材料与方法 | 第42-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第42-43页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第42-43页 |
| 2.1.2 培养基 | 第43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-46页 |
| 2.2.1 辅助噬菌体的活化 | 第43页 |
| 2.2.2 噬菌体展示库的富集与淘选 | 第43-44页 |
| 2.2.3 噬菌体ELISA检测IFN-γ特异性的单链抗体 | 第44页 |
| 2.2.4 抗IFN-γ单链抗体DNA的扩增与测序 | 第44页 |
| 2.2.5 重组载体构建 | 第44页 |
| 2.2.6 重组载体的诱导表达与可溶性分析 | 第44-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-51页 |
| 3.1 噬菌体展示单链抗体库的生物淘选 | 第46-47页 |
| 3.2 噬菌体单链抗体ELISA检测 | 第47-48页 |
| 3.3 ScFv-A8的核苷酸序列分析 | 第48-49页 |
| 3.4 基于scFv重组表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 3.5 pBD-mbp-Linker-scFv的可溶性表达 | 第50页 |
| 3.6 scFv重组蛋白抗原结合活性分析 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51页 |
| 4.1 免疫小鼠脾细胞提取RNA | 第51页 |
| 4.2 噬菌体单链抗体突变库的生物淘选 | 第51页 |
| 5 小结 | 第51-53页 |
| 第五章 单链抗体ELISA检测IFN-γ方法的建立 | 第53-62页 |
| 1 引言 | 第53页 |
| 2 材料与方法 | 第53-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第53页 |
| 2.2 实验方法 | 第53-55页 |
| 2.2.1 pBD-mbp-linker-scFv重组载体的表达、纯化 | 第53页 |
| 2.2.2 抗体亲和力常数测定 | 第53-54页 |
| 2.2.3 抗体亲特异性测定 | 第54页 |
| 2.2.4 抗体ELISA方法建立 | 第54页 |
| 2.2.5 模拟样品的测定 | 第54页 |
| 2.2.6 实际样品的测定 | 第54-55页 |
| 3 结果与分析 | 第55-61页 |
| 3.1 pBD载体体质粒提取与PCR扩增scFv基因 | 第55页 |
| 3.2 抗体的表达、纯化 | 第55-57页 |
| 3.3 Western Blotting | 第57页 |
| 3.4 抗体的亲和力测定 | 第57-58页 |
| 3.5 抗体的特异性测定 | 第58-59页 |
| 3.6 抗体的竞争ELISA测定 | 第59-60页 |
| 3.7 样品回收率和精确度的测定 | 第60页 |
| 3.8 实际样品的测定 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61页 |
| 4.1 关于IFN-γ的检测方法的建立 | 第61页 |
| 5 小结 | 第61-62页 |
| 第六章 全文总结与展望 | 第62-63页 |
| 1 全文总结 | 第62页 |
| 2 展望 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 附录 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
