| 中文摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1. 前言 | 第12-32页 |
| 1.1 嗜热真菌及其遗传转化 | 第12-17页 |
| 1.1.1 嗜热真菌 | 第12页 |
| 1.1.2 嗜热真菌的遗传转化 | 第12-17页 |
| 1.1.2.1 醋酸锂转化法 | 第12-13页 |
| 1.1.2.2 原生质体-PEG转化方法 | 第13页 |
| 1.1.2.3 电击转化法 | 第13页 |
| 1.1.2.4 农杆菌介导的转化法 | 第13-17页 |
| 1.2 蛋白激酶(protein kinase,PK) | 第17-25页 |
| 1.2.1 蛋白激酶的定义与结构 | 第17-18页 |
| 1.2.2 蛋白激酶的生化特征 | 第18页 |
| 1.2.3 蛋白激酶的分类 | 第18-20页 |
| 1.2.4 几种重要的蛋白激酶 | 第20-23页 |
| 1.2.4.1 蛋白激酶A | 第20页 |
| 1.2.4.2 蛋白激酶B | 第20-21页 |
| 1.2.4.3 蛋白激酶C | 第21-22页 |
| 1.2.4.4 促分裂蛋白激酶 | 第22-23页 |
| 1.2.5 疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶 | 第23-24页 |
| 1.2.6 蛋白激酶的调控机制 | 第24页 |
| 1.2.6.1 蛋白激酶对底物的调节方式 | 第24页 |
| 1.2.6.2 蛋白激酶活性的激活与抑制 | 第24页 |
| 1.2.7 蛋白激酶在细胞信号传导中的作用 | 第24-25页 |
| 1.3 丝状真菌基因功能研究的技术 | 第25-30页 |
| 1.3.1 基因敲除 | 第26页 |
| 1.3.2 RNA干扰(RNA interference,RNAi) | 第26-27页 |
| 1.3.3 酵母单/双杂交技术 | 第27-28页 |
| 1.3.3.1 酵母单杂交系统 | 第27页 |
| 1.3.3.2 酵母双杂交系统 | 第27-28页 |
| 1.3.4 转座子标签技术 | 第28页 |
| 1.3.5 基因捕获技术 | 第28-29页 |
| 1.3.6 超表达 | 第29-30页 |
| 1.4 选题的目的意义、研究内容与技战术路线 | 第30-32页 |
| 1.4.1 目的意义 | 第30页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第30-31页 |
| 1.4.3 技术路线 | 第31-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-52页 |
| 2.1 材料 | 第32-37页 |
| 2.1.1 供试菌株与转化质粒 | 第32页 |
| 2.1.2 酶与生化试剂 | 第32页 |
| 2.1.3 仪器 | 第32-33页 |
| 2.1.4 溶液配制 | 第33-34页 |
| 2.1.5 培养基 | 第34-37页 |
| 2.2 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的筛选 | 第37-40页 |
| 2.2.1 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化 | 第37页 |
| 2.2.2 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的PCR验证 | 第37-39页 |
| 2.2.2.1 突变体总DNA的提取 | 第37-38页 |
| 2.2.2.2 PCR验证 | 第38-39页 |
| 2.2.3 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的遗传稳定性检测 | 第39页 |
| 2.2.4 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的菌落形态观察 | 第39-40页 |
| 2.3 疏绵状嗜热真菌蛋白激酶表达载体的构建 | 第40-48页 |
| 2.3.1 蛋白激酶pspk片段的获取 | 第40-45页 |
| 2.3.1.1 疏绵状嗜热丝孢菌总RNA的提取 | 第40-41页 |
| 2.3.1.2 蛋白激酶pspk cDNA的获得 | 第41-42页 |
| 2.3.1.3 蛋白激酶pspk引物设计 | 第42页 |
| 2.3.1.4 蛋白激酶pspk cDNA的扩增 | 第42-43页 |
| 2.3.1.5 PCR产物回收 | 第43页 |
| 2.3.1.6 回收产物与载体pMD18-T连接 | 第43页 |
| 2.3.1.7 大肠杆菌感受态的转化 | 第43-44页 |
| 2.3.1.8 菌落PCR检测 | 第44-45页 |
| 2.3.1.9 序列测定与分析 | 第45页 |
| 2.3.2 蛋白激酶表达载体的构建 | 第45-48页 |
| 2.3.2.1 质粒pMD18-T-pspk的提取 | 第45-46页 |
| 2.3.2.2 质粒pMD18-T-pspk与pROKⅡ-hygro的线性化 | 第46页 |
| 2.3.2.3 线性化片段连接 | 第46-47页 |
| 2.3.2.4 重组质粒pROKⅡ-hygro-pspk的PCR验证与酶切验证 | 第47-48页 |
| 2.4 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶表达载体的遗传转化 | 第48-52页 |
| 2.4.1 表达载体pROKⅡ-hygro-pspk转化至农杆菌LBA4404感受态细胞 | 第48页 |
| 2.4.2 重组农杆菌菌株的鉴定 | 第48-49页 |
| 2.4.3 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶表达载体的遗传转化 | 第49页 |
| 2.4.4 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶表达载体的遗传转化系统的优化 | 第49页 |
| 2.4.4.1 农杆菌菌株的影响 | 第49页 |
| 2.4.4.2 孢子萌发时间的影响 | 第49页 |
| 2.4.4.3 乙酰丁香酮(AS)浓度的影响 | 第49页 |
| 2.4.4.4 疏绵状嗜热丝孢菌的孢子浓度的影响 | 第49页 |
| 2.4.5 疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因的过量表达菌株的鉴定 | 第49-51页 |
| 2.4.5.1 转化菌株总RNA的提取 | 第49-50页 |
| 2.4.5.2 转化菌株cDNA的克隆 | 第50页 |
| 2.4.5.3 荧光定量PCR | 第50-51页 |
| 2.4.6 蛋白激酶基因过量表达菌株的遗传稳定性测定 | 第51页 |
| 2.4.7 过量表达菌株的表型与生理生化变化研究与分析 | 第51-52页 |
| 2.4.7.1 菌株耐热性的比较 | 第51页 |
| 2.4.7.2 菌落形态比较 | 第51页 |
| 2.4.7.3 孢子萌发速度的比较 | 第51-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-72页 |
| 3.1 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的筛选 | 第52-57页 |
| 3.1.1 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的PCR验证 | 第52页 |
| 3.1.2 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的遗传稳定性检测 | 第52-53页 |
| 3.1.3 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的菌落形态观察 | 第53-57页 |
| 3.2 疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因表达载体的构建 | 第57-62页 |
| 3.2.1 蛋白激酶pspk片段的获取 | 第57-59页 |
| 3.2.1.1 疏绵状嗜热丝孢菌总RNA的提取 | 第57页 |
| 3.2.1.2 蛋白激酶pspk cDNA的获得 | 第57-59页 |
| 3.2.2 蛋白激酶表达载体pROKⅡ-hygro-pspk的构建 | 第59-62页 |
| 3.2.2.1 质粒pMD18-T-pspk与pROKⅡ-hygro的线性化 | 第59-60页 |
| 3.2.2.2 线性化片段连接与验证 | 第60-62页 |
| 3.3 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶表达载体的遗传转化 | 第62-72页 |
| 3.3.1 转化条件对质粒pROKⅡ-hygro-pspk转化效率的影响 | 第62-64页 |
| 3.3.1.1 农杆菌菌株的影响 | 第62页 |
| 3.3.1.2 孢子萌发时间的影响 | 第62-63页 |
| 3.3.1.3 乙酰丁香酮(AS)浓度的影响 | 第63页 |
| 3.3.1.4 疏绵状嗜热丝孢菌孢子浓度的影响 | 第63-64页 |
| 3.3.2 疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因的过量表达菌株的鉴定 | 第64-67页 |
| 3.3.2.1 转化菌株总cDNA的获得 | 第64页 |
| 3.3.2.2 荧光定量PCR | 第64-66页 |
| 3.2.2.3 蛋白激酶基因表达量差异的分析 | 第66-67页 |
| 3.3.3 过量表达菌株的表型与生理生化变化研究与分析 | 第67-72页 |
| 3.3.3.1 菌株耐热性的比较 | 第67-71页 |
| 3.3.3.2 菌落形态比较 | 第71页 |
| 3.3.3.3 孢子萌发速度的比较 | 第71-72页 |
| 4 讨论 | 第72-77页 |
| 4.1 疏绵状嗜热丝孢菌突变体的筛选 | 第72页 |
| 4.2 疏绵状嗜热真菌蛋白激酶表达载体的构建 | 第72-73页 |
| 4.3 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶表达载体的遗传转化 | 第73-77页 |
| 4.3.1 农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶表达载体的遗传转化系统的优化 | 第73-75页 |
| 4.3.1.1 农杆菌菌株的影响 | 第73-74页 |
| 4.3.1.2 孢子萌发时间的影响 | 第74页 |
| 4.3.1.3 乙酰丁香酮(AS)浓度的影响 | 第74页 |
| 4.3.1.4 疏绵状嗜热丝孢菌孢子浓度的影响 | 第74-75页 |
| 4.3.2 疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因的过量表达菌株的获得 | 第75页 |
| 4.3.3 过量表达菌株的表型与生理生化变化研究与分析 | 第75-77页 |
| 5 结论与建议 | 第77-79页 |
| 5.1 结论 | 第77页 |
| 5.2 建议 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-88页 |
| 致谢 | 第88-89页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第89页 |
