| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-25页 |
| 1.1 芦丁和槲皮素 | 第13页 |
| 1.2 芦丁降解酶的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.2.1 芦丁降解酶 | 第13-15页 |
| 1.2.2 微生物中水解芦丁的酶 | 第15页 |
| 1.3 β-糖苷酶的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.3.1 β-糖苷酶的分类 | 第15-16页 |
| 1.3.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制 | 第16-17页 |
| 1.4 蛋白酶的糖基化修饰 | 第17-21页 |
| 1.4.1 糖基化修饰类型 | 第17-18页 |
| 1.4.2 糖基化修饰的作用 | 第18-21页 |
| 1.5 P.pastoris表达系统 | 第21-22页 |
| 1.6 CRISPR-cas9技术 | 第22-23页 |
| 1.6.1 CRISPR-cas9技术简介 | 第22页 |
| 1.6.2 CRISPR-cas9技术及研究进展 | 第22-23页 |
| 1.6.3 原生质体 | 第23页 |
| 1.7 研究目的及意义 | 第23-25页 |
| 第二章 苦荞芦丁降解酶的重组表达及活性测定 | 第25-39页 |
| 2.1 试剂与材料 | 第25-27页 |
| 2.1.1 菌株 | 第25页 |
| 2.1.2 试剂 | 第25页 |
| 2.1.3 仪器 | 第25页 |
| 2.1.4 试剂配制 | 第25-27页 |
| 2.2 实验步骤 | 第27-33页 |
| 2.2.1 重组载体pET15b-SUMO-RDE和pPPIC(Z)A-RDE的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.2 RDE的诱导表达 | 第28-32页 |
| 2.2.3 rRDE的纯化 | 第32页 |
| 2.2.4 重组rRDE的活性测定 | 第32-33页 |
| 2.3 结果与分析 | 第33-37页 |
| 2.3.1 目的基因rRDE的扩增 | 第33页 |
| 2.3.2 pET15b-SUMO-RDE、pPPICZ(α)A-RDE表达载体的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.3 RDE在原核细胞中的诱导表达和可溶性分析 | 第34页 |
| 2.3.4 RDE在P.pastorisSMD1168H中分泌表达及纯化 | 第34-35页 |
| 2.3.5 重组蛋白的活性测定 | 第35-36页 |
| 2.3.6 温度和pH对rRDE催化活性的影响 | 第36-37页 |
| 2.3.7 rRDE的动力学参数的测定 | 第37页 |
| 2.4 讨论 | 第37-39页 |
| 第三章 苦荞芦丁降解酶催化机制研究 | 第39-47页 |
| 3.1 试剂与材料 | 第39页 |
| 3.2 实验步骤 | 第39-41页 |
| 3.2.1 芦丁降解酶活性位点预测 | 第39页 |
| 3.2.2 突变体载体的构建 | 第39-40页 |
| 3.2.3 芦丁降解酶突变体的纯化 | 第40-41页 |
| 3.2.4 芦丁降解酶突变体的活性测定 | 第41页 |
| 3.3 结果与分析 | 第41-44页 |
| 3.3.1 活性位点预测 | 第41页 |
| 3.3.2 突变体的质粒PCR鉴定 | 第41-42页 |
| 3.3.3 突变体的测序结果分析 | 第42页 |
| 3.3.4 突变体蛋白的诱导表达及纯化 | 第42-43页 |
| 3.3.5 突变体活性测定结果 | 第43-44页 |
| 3.4 讨论 | 第44-47页 |
| 第四章 N-糖基化修饰对芦丁降解酶活性的影响 | 第47-58页 |
| 4.1 试剂与材料 | 第47页 |
| 4.2 实验步骤 | 第47-49页 |
| 4.2.1 芦丁降解酶N-糖基化修饰位点预测 | 第47页 |
| 4.2.2 突变体载体的构建 | 第47-48页 |
| 4.2.3 芦丁降解酶突变体的纯化 | 第48页 |
| 4.2.4 芦丁降解酶突变体的活性测定 | 第48页 |
| 4.2.5 OsPNGaseA对芦丁降解酶的去糖基化 | 第48-49页 |
| 4.3 结果与分析 | 第49-56页 |
| 4.3.1 活性位点预测 | 第49-50页 |
| 4.3.2 突变基因的获得 | 第50页 |
| 4.3.3 突变体的测序结果分析 | 第50-51页 |
| 4.3.4 突变体蛋白的诱导表达及纯化 | 第51-52页 |
| 4.3.5 N-糖基化修饰的突变对重组酶rRDE热稳定性的影响 | 第52页 |
| 4.3.6 突变体活性测定结果 | 第52-53页 |
| 4.3.7 OsPNGaseA对芦丁降解酶的去糖基化 | 第53-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-58页 |
| 第五章 芦丁降解酶的基因敲除和过表达载体构建 | 第58-67页 |
| 5.1 试剂与材料 | 第58-59页 |
| 5.2 方法 | 第59-62页 |
| 5.2.1 芦丁降解酶的基因敲除载体及过表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 5.2.2 苦荞叶肉细胞的原生质体制备及敲除载体的瞬时转化 | 第60-61页 |
| 5.2.3 RDE在烟草叶片中的瞬时表达 | 第61页 |
| 5.2.4 RDE的叶盘法转化烟草 | 第61-62页 |
| 5.3 结果 | 第62-65页 |
| 5.3.1 pCAMBIA3301-RDE过表达载体和pBSE401-RDE敲除载体的构建 | 第62-63页 |
| 5.3.2 苦荞叶肉细胞的原生质体制备及敲除载体的瞬时转化 | 第63页 |
| 5.3.3 RDE在烟草叶片中的瞬时表达 | 第63-64页 |
| 5.3.4 转RDE基因的烟草植株 | 第64页 |
| 5.3.5 RDE转基因烟草的初步PCR鉴定 | 第64-65页 |
| 5.4 讨论 | 第65-67页 |
| 第六章 结论 | 第67-68页 |
| 6.1 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 附录 | 第74-77页 |
| 附录1：pPICZ(α)A载体图谱 | 第74-75页 |
| 附录2：pCAMBIA3301-RDE-eGFP(A)和pBSE401(B)载体图谱 | 第75-76页 |
| 附录3：RDE编码序列(下划线标识信号肽序列) | 第76-77页 |
| 缩略词 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 作者简介 | 第79页 |
