| 致谢 | 第4-5页 |
| 中文摘要 | 第5-8页 |
| Summary | 第8页 |
| 缩略语表 | 第11-19页 |
| 第一部分 研究背景(文献综述) | 第19-67页 |
| 第一章 双生病毒-一类值得重视的植物病毒 | 第19-31页 |
| 1 双生病毒的危害性有加重趋势 | 第19-20页 |
| 2 重组是双生病毒变异和病害流行的重要原因 | 第20-21页 |
| 3 双生病毒伴随有小分子DNA | 第21-24页 |
| 3.1 类似Nanovirus属病毒的DNA1与双生病毒相伴随 | 第22-23页 |
| 3.2 DNAβ与双生病毒致病性相关 | 第23-24页 |
| 4 双生病毒与小分子DNA形成病害复合体 | 第24-25页 |
| 5 双生病毒与小分子DNA的进化关系 | 第25-27页 |
| 6 存在的问题 | 第27-31页 |
| 第二章 双生病毒致病分子机理研究进展 | 第31-51页 |
| 1 双生病毒的基因组结构 | 第31-33页 |
| 1.1 玉米线条病毒属 | 第31-32页 |
| 1.2 甜菜曲顶病毒属和番茄伪曲顶病毒属 | 第32页 |
| 1.3 菜豆金色花叶病毒属 | 第32-33页 |
| 2 双生病毒编码的蛋白及功能 | 第33-40页 |
| 2.1 外壳蛋白 | 第33-35页 |
| 2.2 复制蛋白和复制增强蛋白 | 第35-38页 |
| 2.3 与运动有关的病毒蛋白及功能 | 第38-40页 |
| 3 双生病毒调控植物细胞周期与病毒复制和症状形成的关系 | 第40-43页 |
| 4 双生病毒抑制植物RNA沉默与病毒侵染和症状形成的关系 | 第43-45页 |
| 5 存在的问题与展望 | 第45-51页 |
| 第三章 RNA沉默的病毒抑制子 | 第51-67页 |
| 1 RNA沉默简介 | 第51-52页 |
| 2 RNA沉默是一种植物固有的抗病毒防卫反应 | 第52-54页 |
| 3 RNA沉默的病毒抑制子的发现和多样性 | 第54-57页 |
| 3.1 RNA沉默抑制子的发现和已鉴定的沉默抑制子 | 第54页 |
| 3.2 沉默抑制子的鉴定方法 | 第54-57页 |
| 4 沉默抑制子的作用方式和抑制沉默的分子机理 | 第57-59页 |
| 4.1 马铃薯Y病毒属的HC-Pro干扰RISC的形成 | 第57-58页 |
| 4.2 番茄丛矮病毒属的P19阻碍siRNA整合入KISC | 第58-59页 |
| 4.3 CMV 2b干扰沉默信号的长距离移动 | 第59页 |
| 5 沉默抑制子与病毒病症状形成的关系 | 第59-61页 |
| 6 动物病毒的RNA沉默抑制子 | 第61-62页 |
| 7 沉默抑制子的应用 | 第62-63页 |
| 7.1 解析RNA沉默的途径 | 第62-63页 |
| 7.2 增强外源蛋白的表达 | 第63页 |
| 8 存在的问题与展望 | 第63-67页 |
| 第二部分 实验研究 | 第67-169页 |
| 第一章 材料与方法 | 第67-81页 |
| 1 材料 | 第67-68页 |
| 1.1 植物材料 | 第67页 |
| 1.2 病毒侵染性克隆 | 第67页 |
| 1.3 菌株和质粒 | 第67页 |
| 1.4 试剂与仪器 | 第67页 |
| 1.5 常用缓冲液的配制 | 第67-68页 |
| 2 方法 | 第68-81页 |
| 2.1 PCR技术 | 第68-69页 |
| 2.2 PCR产物纯化 | 第69-70页 |
| 2.3 DNA克隆技术 | 第70-71页 |
| 2.4 重组质粒的提取与鉴定 | 第71-72页 |
| 2.5 外源基因在大肠杆菌中的表达、蛋白质纯化和抗体制备 | 第72-74页 |
| 2.6 SDS-PAGE与Western印迹分析 | 第74-76页 |
| 2.7 植物总DNA提取和Southern印迹分析 | 第76-78页 |
| 2.8 植物总RNA提取和Northern印迹分析 | 第78-81页 |
| 第二章 两种双生病毒DNAβ分子βC1基因在大肠杆菌中的表达和抗体制备 | 第81-88页 |
| 1 材料与方法 | 第81-82页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第81页 |
| 1.2 DNAβ分子βC1基因的克隆和原核表达载体构建 | 第81-82页 |
| 1.3 诱导表达和蛋白纯化 | 第82页 |
| 1.4 抗体制备和Western印迹分析 | 第82页 |
| 2 结果与分析 | 第82-85页 |
| 2.1 利用pGEX-4T-1载体在大肠杆菌中表达GST融合蛋白 | 第82-84页 |
| 2.2 利用pET-30a载体在大肠杆菌中表达His融合蛋白 | 第84页 |
| 2.3 蛋白纯化和抗体制备 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-88页 |
| 第三章 双生病毒DNAβ分子βC1蛋白的核酸结合特性 | 第88-97页 |
| 1 材料与方法 | 第88-90页 |
| 1.1 质粒和试剂 | 第88页 |
| 1.2 重组蛋白在变性条件下的大量纯化和复性 | 第88-89页 |
| 1.3 探针标记与纯化 | 第89页 |
| 1.4 UV交联分析 | 第89页 |
| 1.5 电泳迁移率变动试验 | 第89-90页 |
| 2 结果与分析 | 第90-94页 |
| 2.1 DNAβ编码的βC1蛋白结合单和双链DNA | 第90-91页 |
| 2.2 NaCl浓度对DNAβ编码的βC1蛋白结合DNA的影响 | 第91页 |
| 2.3 DNAβ编码的βC1蛋白对DNA的结合无序列特异性 | 第91-94页 |
| 3 讨论 | 第94-97页 |
| 第四章 双生病毒DNAβ分子βC1蛋白的亚细胞定位 | 第97-111页 |
| 1 材料与方法 | 第97-101页 |
| 1.1 质粒与试剂 | 第97页 |
| 1.2 TYLCCNV Y10β分子βC1蛋白在洋葱表皮细胞中的定位 | 第97-99页 |
| 1.3 TYLCCNV Y10β分子βC1蛋白在sf21昆虫细胞中的定位 | 第99-101页 |
| 1.4 TYLCCNV Y10β分子βC1蛋白亚细胞定位信号的初步研究 | 第101页 |
| 2 结果与分析 | 第101-106页 |
| 2.1 βC1基因及突变体与GUS或GFP基因融合表达载体的构建 | 第101-103页 |
| 2.2 βC1蛋白在洋葱表皮细胞中的定位 | 第103页 |
| 2.3 βC1蛋白在昆虫细胞中的定位 | 第103-104页 |
| 2.4 βC1蛋白亚细胞定位信号的初步研究 | 第104-106页 |
| 3 讨论 | 第106-111页 |
| 第五章 表达中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ分子βC1基因的转基因烟草产生病毒病样的症状 | 第111-125页 |
| 1 材料与方法 | 第111-114页 |
| 1.1 植物表达载体的构建 | 第111-112页 |
| 1.2 本氏烟和普通烟的遗传转化 | 第112页 |
| 1.3 转基因烟草的分子鉴定 | 第112-113页 |
| 1.4 光学显微镜 | 第113-114页 |
| 2 结果与分析 | 第114-120页 |
| 2.1 植物表达载体的构建和鉴定 | 第114-115页 |
| 2.2 转基因烟草的获得和表型分析 | 第115-116页 |
| 2.3 转基因烟草的DNA和RNA分析 | 第116-120页 |
| 2.4 Western印迹分析转基因烟草和感病植株中βC1蛋白的表达 | 第120页 |
| 3 讨论 | 第120-125页 |
| 第六章 双生病毒DNAβ分子βC1蛋白为RNA沉默的抑制子 | 第125-143页 |
| 1 材料与方法 | 第126-128页 |
| 1.1 材料 | 第126页 |
| 1.2 载体构建 | 第126-127页 |
| 1.3 农杆菌浸润接种 | 第127页 |
| 1.4 GFP荧光观察和拍照 | 第127-128页 |
| 1.5 Northern印迹分析 | 第128页 |
| 1.6 Western印迹分析 | 第128页 |
| 2 结果与分析 | 第128-139页 |
| 2.1 农杆菌瞬时表达沉默诱导体系的建立 | 第128页 |
| 2.2 DNAβ分子参与抑制RNA沉默 | 第128-132页 |
| 2.3 DNAβ编码的βC1蛋白为RNA沉默的抑制子 | 第132-137页 |
| 2.4 双生病毒编码的C2和C4蛋白为RNA沉默的抑制子 | 第137-139页 |
| 3 讨论 | 第139-143页 |
| 第七章 中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ分子βC1基因缺失和定点突变分析 | 第143-151页 |
| 1 材料与方法 | 第143-146页 |
| 1.1 材料 | 第143页 |
| 1.2 βC1基因缺失或定点突变的Y10β突变体侵染性克隆的构建 | 第143-144页 |
| 1.3 突变体的侵染性和致病性测定 | 第144-146页 |
| 1.4 PCR和Southern印迹分析 | 第146页 |
| 2 结果与分析 | 第146-149页 |
| 2.1 βC1基因缺失或定点突变的Y10β突变体侵染性克隆的构建 | 第146-147页 |
| 2.2 突变体的侵染性和致病性分析 | 第147-149页 |
| 2.3 突变体的复制能力 | 第149页 |
| 3 讨论 | 第149-151页 |
| 第八章 云南烟草曲叶病毒伴随的DNAβ分子的鉴定 | 第151-160页 |
| 1 材料与方法 | 第151-153页 |
| 1.1 毒源 | 第151页 |
| 1.2 总DNA提取和PCR扩增 | 第151-152页 |
| 1.3 克隆和筛选 | 第152页 |
| 1.4 限制内切酶消化 | 第152页 |
| 1.5 序列测定与分析 | 第152-153页 |
| 2 结果与分析 | 第153-158页 |
| 2.1 DNAβ分子与TbLCYNV相伴随 | 第153页 |
| 2.2 序列比较表明TbLCYNV伴随有2类DNAβ分子 | 第153-154页 |
| 2.3 与TbLCYNV伴随的DNAβ分子的进化分析 | 第154-156页 |
| 2.4 与TbLCYNV伴随的类型Ⅱ DNAβ分子可能由重组产生 | 第156-158页 |
| 3 讨论 | 第158-160页 |
| 第九章 两种双生病毒复制蛋白基因的原核表达与免疫定位 | 第160-169页 |
| 1 材料与方法 | 第160-162页 |
| 1.1 毒源 | 第160页 |
| 1.2 Rep基因的克隆和原核表达载体构建 | 第160-161页 |
| 1.3 融合蛋白的诱导表达、纯化和抗体制备 | 第161-162页 |
| 1.4 TbCSV Rep蛋白的亚细胞分布 | 第162页 |
| 1.5 TbCSV Rep蛋白的免疫胶体金标记定位 | 第162页 |
| 2 结果与分析 | 第162-165页 |
| 2.1 TYLCCNV和TbCSV Rep基因的表达和抗体的制备 | 第162-164页 |
| 2.2 TbCSV Rep蛋白的亚细胞分布 | 第164-165页 |
| 2.3 TbCSV Rep蛋白的免疫胶体金标记定位 | 第165页 |
| 3 讨论 | 第165-169页 |
| 附录A | 第169-170页 |
| 附录B | 第170-174页 |
