| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-45页 |
| 1.1 引言 | 第13-14页 |
| 1.2 研究蛋白质动力学的常用核磁共振技术 | 第14-37页 |
| 1.2.1 化学交换 | 第14-18页 |
| 1.2.2 弛豫扩散实验 | 第18-20页 |
| 1.2.3 残留偶极耦合 | 第20-22页 |
| 1.2.4 顺磁弛豫增强 | 第22-25页 |
| 1.2.5 赝接触位移 | 第25-31页 |
| 1.2.6 氢氘交换 | 第31-32页 |
| 1.2.7 饱和转移实验 | 第32页 |
| 1.2.8 不可见状态的交换饱和转移实验 | 第32-33页 |
| 1.2.9 化学交换饱和转移实验 | 第33-37页 |
| 1.2.10 线型分析 | 第37页 |
| 1.2.11 其它技术进展 | 第37页 |
| 1.3 基于核磁的蛋白质激发态结构计算研究进展 | 第37-40页 |
| 1.3.1 基于CPMG的激发态结构计算 | 第37-38页 |
| 1.3.2 基于PRE的激发态结构计算 | 第38-39页 |
| 1.3.3 激发态结构计算方法的讨论 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-45页 |
| 第二章 材料方法及样品制备 | 第45-65页 |
| 2.1 克隆及突变体构建 | 第45-52页 |
| 2.1.1 PCR的引物设计 | 第45-46页 |
| 2.1.2 目的基因片段的PCR扩增 | 第46-47页 |
| 2.1.3 目的基因片段的胶回收 | 第47页 |
| 2.1.4 质粒的抽提 | 第47-48页 |
| 2.1.5 目的基因片段及质粒的双酶切 | 第48页 |
| 2.1.6 目的基因片段与质粒的连接 | 第48-49页 |
| 2.1.7 感受态细胞的制备 | 第49页 |
| 2.1.8 连接产物转化进入感受态细胞 | 第49-50页 |
| 2.1.9 单克隆菌的验证 | 第50页 |
| 2.1.10 单克隆菌种测序结果 | 第50-51页 |
| 2.1.11 半胱氨酸突变位点的选取及突变体质粒构建 | 第51-52页 |
| 2.2 蛋白质的表达与纯化 | 第52-56页 |
| 2.2.1 Abp1p SH3结构域的氨基酸序列 | 第52页 |
| 2.2.2 HYPA/FBP11 FF结构域的氨基酸序列 | 第52-53页 |
| 2.2.3 SH3与FF结构域的表达与纯化 | 第53-56页 |
| 2.3 镧系金属螯合标签与蛋白质的连接反应 | 第56-57页 |
| 2.3.1 反应前的蛋白质预处理 | 第56页 |
| 2.3.2 DTNB激活蛋白质半胱氨酸连接位点 | 第56-57页 |
| 2.3.3 镧系金属螯合标签的连接 | 第57页 |
| 2.4 核磁样品的制备 | 第57-58页 |
| 2.4.1 Abp1p SH3-Ark1p体系的核磁样品 | 第57-58页 |
| 2.4.2 FF结构域的核磁样品 | 第58页 |
| 2.4.3 含顺磁金属的样品 | 第58页 |
| 2.5 核磁实验设置 | 第58-60页 |
| 2.5.1 二维~(15)N CEST实验 | 第59-60页 |
| 2.5.2 一维~(15)N CEST实验 | 第60页 |
| 2.6 CEST数据处理与分析 | 第60-64页 |
| 2.6.1 CEST谱图处理及谱峰强度列表的提取 | 第60-63页 |
| 2.6.2 CEST数据的拟合 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-65页 |
| 第三章 用CEST实验观测蛋白质低丰度激发态的PCS | 第65-83页 |
| 3.1 引言 | 第65-66页 |
| 3.2 实验结果 | 第66-77页 |
| 3.2.1 在蛋白质上定点连接镧系金属离子 | 第66-67页 |
| 3.2.2 在Abp1p SH3-Ark1p慢交换体系上验证PCS-CEST | 第67-70页 |
| 3.2.3 应用PCS-CEST探测FF结构域折叠过渡状态的构象 | 第70-74页 |
| 3.2.4 选择性的一维CEST实验可以缩短实验时间、提高数据分辨率 | 第74-76页 |
| 3.2.5 结论 | 第76-77页 |
| 3.3 讨论 | 第77-78页 |
| 3.4 展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-83页 |
| 第四章 LARG PDZ与片段筛选苗头化合物弱相互作用研究 | 第83-105页 |
| 4.1 引言 基于核磁的片段筛选 | 第83-87页 |
| 4.1.1 核磁片段库的构建 | 第83-84页 |
| 4.1.2 用于片段筛选的核磁共振方法 | 第84-86页 |
| 4.1.3 使用稀疏的核磁约束产生复合物结构模型 | 第86-87页 |
| 4.2 研究弱相互作用的核磁技术简介 | 第87页 |
| 4.3 LARG PDZ结构域简介 | 第87-88页 |
| 4.4 材料与方法 | 第88-91页 |
| 4.4.1 LARG PDZ结构域的表达、纯化 | 第88页 |
| 4.4.2 LARG PDZ结构域的片段筛选 | 第88页 |
| 4.4.3 蛋白质RDC样品的制备 | 第88-90页 |
| 4.4.4 蛋白质PCS样品的制备 | 第90页 |
| 4.4.5 蛋白质PRE样品的制备 | 第90-91页 |
| 4.4.6 QNMR的方法定量小分子的浓度 | 第91页 |
| 4.4.7 trPCS与trPRE实验的样品条件 | 第91页 |
| 4.5 实验结果 | 第91-100页 |
| 4.5.1 LARG PDZ结构域的片段筛选 | 第91-92页 |
| 4.5.2 片段的初步演化 | 第92-94页 |
| 4.5.3 PDZ与苗头化合物弱相互作用的初步实验结果 | 第94-100页 |
| 4.6 总结与展望 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-105页 |
| 附录 | 第105-139页 |
| 附录一 CEST数据处理所用到的脚本 | 第105-129页 |
| 脚本一：Perl脚本NCEST_2ft2.pl | 第105-113页 |
| 脚本二：Matlab脚本Height2.m | 第113-120页 |
| 脚本三：Python脚本ChemEx_cfgGen_2015.py | 第120-129页 |
| 附录二 根据化学位移滴定拟合K_D值的MATLAB脚本K2.m | 第129-139页 |
| 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议 | 第139-141页 |
| 致谢 | 第141页 |
