| 中文摘要 | 第4-8页 |
| abstract | 第8-11页 |
| 引言 | 第17-23页 |
| 参考文献 | 第21-23页 |
| 第一部分 运用寡义核苷酸玛琳环敲降斑马鱼中铁调素研究对骨代谢的影响 | 第23-44页 |
| 一、前言 | 第23页 |
| 二、材料与方法 | 第23-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.2 实验仪器 | 第24页 |
| 2.3 实验试剂 | 第24-25页 |
| 2.4 常用试剂配制 | 第25-28页 |
| 2.4.1 细菌LB培养基 | 第25-26页 |
| 2.4.2 抗生素 | 第26页 |
| 2.4.3 核酸电泳相关缓冲液 | 第26页 |
| 2.4.4 Inoue法制备超级感受态细胞相关溶液 | 第26页 |
| 2.4.5 原位杂交相关试剂 | 第26-27页 |
| 2.4.6 阿可辛蓝软骨染色及茜素红硬骨染色相关试剂 | 第27-28页 |
| 2.5 引物及注射用Oligo序列 | 第28-29页 |
| 2.6 实验方法及设计 | 第29-35页 |
| 2.6.1 斑马鱼交配产卵 | 第29页 |
| 2.6.2 胚胎总RNA的提取 | 第29页 |
| 2.6.3 mRNA反转成cDNA | 第29-30页 |
| 2.6.5 显微注射 | 第30-31页 |
| 2.6.6 定量PCR以及制作标准曲线 | 第31页 |
| 2.6.7 原位杂交过程 | 第31-33页 |
| 2.6.8 斑马鱼基因组提取 | 第33页 |
| 2.6.9 斑马鱼硬骨及软骨染色 | 第33-34页 |
| 2.6.10 数据统计分析 | 第34-35页 |
| 三、结果 | 第35-40页 |
| 3.1 通过显微注射进行斑马鱼铁调素的敲降 | 第35页 |
| 3.2. 通过PCR进行进行鉴定效果 | 第35-36页 |
| 3.3. 通过铁色发现铁调素敲降至铁过载 | 第36-37页 |
| 3.4. 骨染色发现铁调素敲降使得骨矿化减少，而软骨变化不大 | 第37-38页 |
| 3.5. 定量QPCR验证铁过载致成骨相关的基因下调 | 第38-39页 |
| 3.6. 原位杂交在在体情况下进一步验证铁过载致成骨相关的基因下调 | 第39-40页 |
| 四、结论 | 第40-41页 |
| 五、讨论 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-44页 |
| 第二部分 铁调素绿色荧光蛋白转基因斑马鱼在体研究对骨代谢的影响 | 第44-63页 |
| 一、前言 | 第44页 |
| 二、材料与方法 | 第44-54页 |
| 2.1 实验材料 | 第44页 |
| 2.2 实验仪器 | 第44-45页 |
| 2.3 实验试剂 | 第45-46页 |
| 2.4 常用试剂配制 | 第46-49页 |
| 2.4.1 细菌LB培养基 | 第46页 |
| 2.4.2 抗生素 | 第46-47页 |
| 2.4.3 核酸电泳相关缓冲液 | 第47页 |
| 2.4.4 Inoue法制备超级感受态细胞相关溶液 | 第47页 |
| 2.4.5 原位杂交相关试剂 | 第47页 |
| 2.4.6 阿可辛蓝软骨染色及茜素红硬骨染色相关试剂 | 第47-49页 |
| 2.5 引物及注射用Oligo序列 | 第49页 |
| 2.6 实验方法及设计 | 第49-54页 |
| 2.6.1 斑马鱼交配产卵 | 第49-50页 |
| 2.6.2 胚胎总RNA的提取 | 第50页 |
| 2.6.3 mRNA反转成cDNA | 第50-51页 |
| 2.6.5 显微注射 | 第51页 |
| 2.6.6 定量PCR以及制作标准曲线 | 第51-52页 |
| 2.6.7 MO定制由美国Gene Tool公司设计并验证活性和效果，直接加染料（枫红）0.1ul和Tris盐酸 0.1ul后进行显微注射 | 第52页 |
| 2.6.8 斑马鱼基因组提取 | 第52页 |
| 2.6.9 斑马鱼硬骨及软骨染色 | 第52-53页 |
| 2.6.10 数据统计分析 | 第53-54页 |
| 三、结果 | 第54-59页 |
| 3.1. 成功构建铁调素绿色荧光蛋白质粒 | 第54页 |
| 3.2. 显微注射铁调素绿色荧光蛋白质粒观察96小时表达最明显 | 第54-55页 |
| 3.3. 通过荧光实验进行鉴定效果 | 第55-56页 |
| 3.4. 抑制铁调素表达致铁过载 | 第56-57页 |
| 3.5. 抑制铁调素表达致骨矿化减少 | 第57-58页 |
| 3.6. 通过定量实验发现其铁调素下降使得成骨基因下调 | 第58-59页 |
| 四、结论 | 第59页 |
| 五、讨论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-63页 |
| 第三部分 运用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼铁调素基因研究铁蓄积对骨代谢的影响和机制 | 第63-100页 |
| 一、前言 | 第63页 |
| 二、材料与方法 | 第63-82页 |
| 2.1 实验材料 | 第63页 |
| 2.2 实验仪器 | 第63-64页 |
| 2.3 实验试剂 | 第64-65页 |
| 2.4 常用试剂配制 | 第65-68页 |
| 2.4.1 细菌LB培养基 | 第65页 |
| 2.4.2 抗生素 | 第65-66页 |
| 2.4.3 核酸电泳相关缓冲液 | 第66页 |
| 2.4.4 Inoue法制备超级感受态细胞相关溶液 | 第66页 |
| 2.4.5 原位杂交相关试剂 | 第66页 |
| 2.4.6 阿可辛蓝软骨染色及茜素红硬骨染色相关试剂 | 第66-68页 |
| 2.5 引物及注射用Oligo序列 | 第68-69页 |
| 2.6 实验方法及设计 | 第69-82页 |
| 2.6.1 斑马鱼交配产卵 | 第69页 |
| 2.6.2 胚胎总RNA的提取 | 第69-70页 |
| 2.6.3 mRNA反转成cDNA | 第70-71页 |
| 2.6.5 胶回收（试剂盒） | 第71-72页 |
| 2.6.6 目的片段链接载体及酶切鉴定 | 第72页 |
| 2.6.7 制备感受态细胞 | 第72-73页 |
| 2.6.8 转化 | 第73页 |
| 2.6.9 转化试验重组体的PCR鉴定 | 第73页 |
| 2.6.10 质粒的提取(试剂盒) | 第73-74页 |
| 2.6.11 原位杂交探针合成 | 第74-75页 |
| 2.6.12 显微注射 | 第75页 |
| 2.6.13 定量PCR以及制作标准曲线 | 第75页 |
| 2.6.14 原位杂交过程 | 第75-77页 |
| 2.6.15 斑马鱼基因组提取 | 第77-78页 |
| 2.6.16 斑马鱼硬骨及软骨染色 | 第78-79页 |
| 2.6.17 蛋白免疫共沉淀（CoIP Assay） | 第79页 |
| 2.6.18 DNA定点突变 | 第79页 |
| 2.6.19 细胞实验 | 第79-80页 |
| 2.6.20 拯救实验 | 第80页 |
| 2.6.21 微型计算机断层成像（micro-CT）分析 | 第80页 |
| 2.6.22 运用CAS9的方法获得hepcidin突变体 | 第80-81页 |
| 2.6.23 高通量测序 | 第81页 |
| 2.6.24 染色质免疫沉淀（Ch IP Assay）Ch IP | 第81页 |
| 2.6.25 MO定制由美国Gene Tool公司设计并验证活性和效果，直接加染料（枫红）0.1ul和Tris盐酸 0.1ul后进行显微注射 | 第81页 |
| 2.6.26 进化树构建和分析 | 第81-82页 |
| 2.6.27 数据统计分析 | 第82页 |
| 三、实验结果与分析 | 第82-94页 |
| 3.1 在斑马鱼中，Hepcidin蛋白功能域具有很强的保守性 | 第82-83页 |
| 3.2 在斑马鱼中，通过CRISPR/CAS9手段敲除hepcidin基因 | 第83-85页 |
| 3.3 在幼鱼时期铁染色发现铁蓄积，注射hepcidin的mRNA可以部分拯救 | 第85-86页 |
| 3.4 在幼鱼发现其骨代谢发育有明显缺陷，注射hepcidin的mRNA可以部分拯救 | 第86-87页 |
| 3.5 成年斑马鱼表现为同样的表型 | 第87-88页 |
| 3.6 高通量测序和q-RT-PCR显示成骨下游基因有着明显的下调 | 第88-90页 |
| 3.7 原位杂交和在体敲降铁调素证明其对和基因下调 | 第90-92页 |
| 3.8 细胞实验证明铁蓄积通过bmp2a通道下调成骨runx2a基因 | 第92-94页 |
| 四、结论 | 第94-95页 |
| 五、讨论 | 第95-97页 |
| 5.1 运用斑马鱼来研究hepcidin的功能 | 第95-96页 |
| 5.2 运用该斑马鱼中的hepcidin突变体来研究人类骨骼疾病 | 第96页 |
| 5.3 运用该模型来筛药 | 第96页 |
| 5.4 在体研究铁蓄积对成骨基因的抑制 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-100页 |
| 综述一 以斑马鱼为模式动物研究铁调素在骨质疏松中的作用 | 第100-110页 |
| 参考文献 | 第105-110页 |
| 综述二 锌指结构Sp7对骨骼发育及成骨细胞影响 的研究进展 | 第110-120页 |
| 参考文献 | 第116-120页 |
| 附录 | 第120-121页 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表论著、论文 | 第121-122页 |
| 攻读学位期间获得的奖励和项目 | 第122-123页 |
| 致谢 | 第123-124页 |
