| 摘要 | 第12-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 论文创新点 | 第19-20页 |
| 研究意义 | 第20-21页 |
| 技术路线 | 第21-22页 |
| 第一部分 文献综述 | 第22-44页 |
| 第一章 A型流感病毒研究进展 | 第22-37页 |
| 1 A型流感病毒基因组结构及各蛋白功能研究进展 | 第23-34页 |
| 1.1 碱性聚合酶蛋白2(Basic Polymerase protein 2,PB2) | 第24-25页 |
| 1.2 碱性聚合酶蛋白1(Basic Polymerase protein 1,PB1) | 第25页 |
| 1.3 酸性聚合酶蛋白(Acidic Polymerase protein,PA) | 第25-26页 |
| 1.4 血凝素(Hemagglutinin,HA) | 第26-28页 |
| 1.4.1 HA的一级结构 | 第26-27页 |
| 1.4.2 HA的三维结构 | 第27页 |
| 1.4.3 HA的细胞受体结合位点 | 第27-28页 |
| 1.5 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) | 第28页 |
| 1.6 核蛋白(Nucleoprotein,NP) | 第28-29页 |
| 1.7 基质蛋白(Matrix protein,M) | 第29页 |
| 1.8 非结构蛋白(nonstructural protein,NS) | 第29-33页 |
| 1.8.1 NS1可与多种宿主蛋白发生相互作用 | 第30页 |
| 1.8.2 NS1与宿主的天然免疫反应 | 第30-31页 |
| 1.8.3 NS1效应域的二聚化影响病毒复制及其毒力 | 第31页 |
| 1.8.4 NS1调节第8节段mRNA的剪切 | 第31-32页 |
| 1.8.5 过表达NS1对流感病毒特异性RNA和蛋白质合成的影响 | 第32-33页 |
| 1.8.5.1 瞬时调节病毒RNA合成 | 第32页 |
| 1.8.5.2 选择性翻译病毒mRNA | 第32-33页 |
| 1.9 新发现的病毒蛋白 | 第33-34页 |
| 2 流感病毒的复制 | 第34-37页 |
| 2.1 流感病毒的复制周期 | 第34-36页 |
| 2.1.1 流感病毒的吸附、侵入和脱壳 | 第34-35页 |
| 2.1.2 病毒基因组的复制、转录和翻译 | 第35页 |
| 2.1.3 病毒颗粒的组装和释放 | 第35-36页 |
| 2.2 流感病毒的异常复制和缺损病毒的形成 | 第36-37页 |
| 第二章 核不均一核蛋白家族及其成员研究进展 | 第37-44页 |
| 1 核不均一核蛋白 | 第37-40页 |
| 1.1 A/B蛋白 | 第37-38页 |
| 1.2 C1/C2蛋白 | 第38页 |
| 1.3 I蛋白 | 第38页 |
| 1.4 K/J蛋白 | 第38-39页 |
| 1.5 L蛋白 | 第39页 |
| 1.6 U蛋白 | 第39页 |
| 1.7 其它核不均一核蛋白 | 第39-40页 |
| 2 hnRNP C1/C2的结构与功能简介 | 第40-43页 |
| 2.1 hnRNP C1/C2的结构 | 第40-42页 |
| 2.2 hnRNP C1/C2的功能 | 第42-43页 |
| 3 hnRNP C1/C2可与多种病毒蛋白发生相互作用 | 第43-44页 |
| 第二部分 研究内容 | 第44-107页 |
| 第一章 H5N9亚型流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析 | 第44-57页 |
| 1 材料 | 第45页 |
| 1.1 样本、细胞和鸡胚 | 第45页 |
| 2 实验方法 | 第45-47页 |
| 2.1 样本收集 | 第45-46页 |
| 2.2 RNA抽提和二代测序 | 第46页 |
| 2.3 病毒的分离与鉴定 | 第46页 |
| 2.4 HA受体结合试验 | 第46-47页 |
| 2.5 数据分析 | 第47页 |
| 3 结果 | 第47-54页 |
| 3.1 不同亚型流感病毒混合感染 | 第47-48页 |
| 3.2 H5N9亚型流感病毒的基因组多样性 | 第48-52页 |
| 3.3 H5N9亚型流感病毒的分子特征 | 第52-54页 |
| 3.4 H5N9病毒的受体结合特性 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-57页 |
| 第二章 宿主hnRNP C2与A型流感病毒NS1的相互作用关系研究 | 第57-84页 |
| 1 材料 | 第58-59页 |
| 1.1 毒株、菌株、细胞和鸡胚 | 第58页 |
| 1.2 载体、试剂和抗体 | 第58-59页 |
| 1.3 主要仪器与耗材 | 第59页 |
| 2 实验方法 | 第59-72页 |
| 2.1 病毒基因组RNA的抽提及cDNA第一链的合成 | 第59-61页 |
| 2.2 感受态细胞的制备 | 第61页 |
| 2.3 DNA片段的回收 | 第61页 |
| 2.4 目的片段与载体的双酶切和连接 | 第61-62页 |
| 2.5 转化 | 第62页 |
| 2.6 不同亚型流感病毒NS1基因真核表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 2.7 A/Chicken/Yuhang/1/2013(H5N9)毒株NS1基因不同截短体的构建 | 第63-64页 |
| 2.8 不同标签hnRNP C2真核表达载体的构建 | 第64-65页 |
| 2.9 hnRNP C2精细定位不同截短体的构建 | 第65-66页 |
| 2.10 病毒感染与激光共聚焦实验 | 第66页 |
| 2.11 免疫共沉淀实验(Co-IP) | 第66-67页 |
| 2.12 GST Pull-Down试验 | 第67-70页 |
| 2.13 RNA结合蛋白免疫共沉淀试验(RNA-IP) | 第70-72页 |
| 2.13.1 裂解物的制备 | 第70页 |
| 2.13.2 免疫共沉淀磁珠的准备 | 第70页 |
| 2.13.3 免疫共沉淀 | 第70-71页 |
| 2.13.4 RNA的纯化 | 第71-72页 |
| 3 结果 | 第72-82页 |
| 3.1 宿主hnRNPC2与A型流感病毒不同亚型NS1蛋白的定位情况 | 第72-73页 |
| 3.2 A型流感病毒不同亚型NS1基因与hnRNP C2的相互作用研究 | 第73-75页 |
| 3.3 hnRNPC2互作区域的精细定位研究 | 第75-76页 |
| 3.4 A/Chicken/Yuhang/1/2013(H5N9)-NS1基因互作区域的精细定位研究 | 第76-77页 |
| 3.5 NS1与hnRNP C2的互作需要RNA的参与 | 第77页 |
| 3.6 依赖于RNA互作的拯救实验 | 第77-78页 |
| 3.7 GST Pull-Down试验结果分析 | 第78-79页 |
| 3.8 RNA结合蛋白免疫共沉淀试验结果分析 | 第79-80页 |
| 3.9 NS1蛋白互作区域关键氨基酸位点分析 | 第80-82页 |
| 4 讨论 | 第82-84页 |
| 第三章 A型流感病毒8质粒反向遗传操作系统的建立及突变体病毒的拯救 | 第84-97页 |
| 1 材料 | 第87页 |
| 1.1 毒株、菌株、细胞和鸡胚 | 第87页 |
| 1.2 载体、试剂、抗体和仪器 | 第87页 |
| 2 实验方法 | 第87-91页 |
| 2.1 反向遗传重组技术 | 第87-88页 |
| 2.2 单点、多点及缺失突变体反向遗传载体的构建 | 第88-90页 |
| 2.2.1 定点突变引物设计 | 第88-89页 |
| 2.2.2 基因定点突变反应 | 第89-90页 |
| 2.2.3 Dpn I消化 | 第90页 |
| 2.2.4 转化、挑单克隆鉴定 | 第90页 |
| 2.3 病毒感染的HA效价及TCID_(50)的测定 | 第90-91页 |
| 2.3.1 HA效价的测定 | 第90-91页 |
| 2.3.2 TCID_(50)的测定 | 第91页 |
| 3 结果 | 第91-96页 |
| 3.1 8质粒反向遗传操作系统的构建 | 第91-92页 |
| 3.2 带有不同突变位点重组病毒的拯救 | 第92-93页 |
| 3.3 重组病毒感染情况下的Co-IP试验 | 第93-94页 |
| 3.4 重组病毒的病毒滴度测定 | 第94-96页 |
| 4 讨论 | 第96-97页 |
| 第四章 宿主hnRNP C2在A型流感病毒感染过程中的功能研究 | 第97-107页 |
| 1 材料 | 第97-98页 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞 | 第97页 |
| 1.2 载体、试剂、抗体和仪器 | 第97-98页 |
| 2 实验方法 | 第98-102页 |
| 2.1 A/Chicken/Yuhang/1/2013(H5N9)毒株感染情况下hnRNP C1/C2变化的测定 | 第98页 |
| 2.2 Flag-hnRNP C2的过表达试验 | 第98-99页 |
| 2.3 hnRNP C2有效干扰载体的设计与筛选及RNAi细胞系的构建 | 第99-102页 |
| 2.3.1 Oligo DNA的设计与合成 | 第99-100页 |
| 2.3.2 shRNA载体的构建与筛选 | 第100-101页 |
| 2.3.3 慢病毒介导的shRNA干扰细胞系的构建 | 第101-102页 |
| 2.4 hnRNP C2的干扰试验 | 第102页 |
| 3 结果 | 第102-106页 |
| 3.1 过表达Flag-hnRNP C2可抑制H5N9病毒基因组RNA的复制、转录和病毒蛋白的翻译 | 第102-103页 |
| 3.2 有效干扰shRNA的筛选及干扰细胞系的构建 | 第103-104页 |
| 3.3 hnRNP C2敲低后可促进H5N9病毒基因组RNA的复制、转录和病毒蛋白的翻译 | 第104-106页 |
| 3.4 病毒感染情况下hnRNP C1/C2的变化情况 | 第106页 |
| 4 讨论 | 第106-107页 |
| 全文总结 | 第107-110页 |
| 参考文献 | 第110-127页 |
| 第三部分 附录 | 第127-139页 |
| 附录1 本文所涉及到的引物及重组质粒 | 第127-129页 |
| 附录2 全文缩略语 | 第129-131页 |
| 附录3 常用缓冲液及配方 | 第131-138页 |
| 附录4 攻读博士学位期间学术成果 | 第138-139页 |
| 致谢 | 第139页 |
