| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 缩略语表(ABBREVIATION) | 第14-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-30页 |
| 1. 油菜病毒病 | 第17-22页 |
| 1.1 油菜病毒病发生及危害 | 第17页 |
| 1.2 油菜三种主要病毒的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.2.1 ORMV | 第17-18页 |
| 1.2.2 TuMV | 第18页 |
| 1.2.3 CMV | 第18页 |
| 1.3 植物病毒的检测技术 | 第18-22页 |
| 1.3.1 生物学检测法 | 第18-19页 |
| 1.3.2 电镜检测技术 | 第19页 |
| 1.3.3 血清学检测方法 | 第19-20页 |
| 1.3.3.1 酶联免疫吸附法 | 第19-20页 |
| 1.3.3.2 免疫荧光 | 第20页 |
| 1.3.3.3 免疫胶体金技术 | 第20页 |
| 1.3.4 分子生物学检测方法 | 第20-22页 |
| 1.3.4.1 核酸杂交技术 | 第20页 |
| 1.3.4.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第20-21页 |
| 1.3.4.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) | 第21页 |
| 1.3.4.4 DNA微阵列技术 | 第21-22页 |
| 1.4 病毒病防治策略 | 第22页 |
| 1.4.1 农业防治 | 第22页 |
| 1.4.2 化学防治 | 第22页 |
| 1.4.3 分子育种 | 第22页 |
| 2. 植物转录后基因沉默(PTGS)研究进展 | 第22-25页 |
| 2.1 PTGS机制 | 第22-24页 |
| 2.2 PTGS抗病毒研究进展 | 第24页 |
| 2.3 病毒抵抗植物PTGS研究进展 | 第24-25页 |
| 2.3.1 HC-Pro蛋白 | 第24页 |
| 2.3.2 2b蛋白 | 第24-25页 |
| 2.3.3 P25蛋白 | 第25页 |
| 3. 植物SGS3基因研究进展 | 第25-27页 |
| 3.1 SGS3作用机制 | 第25-26页 |
| 3.2 SGS3的结构和特点 | 第26页 |
| 3.3 SGS3基因的抗病毒研究进展 | 第26-27页 |
| 4. 油菜的遗传转化方法 | 第27-28页 |
| 4.1 农杆菌介导的组培法 | 第27-28页 |
| 4.2 农杆菌介导的浸花法 | 第28页 |
| 4.3 DNA直接导入法 | 第28页 |
| 5. 本研究的目的与意义 | 第28-30页 |
| 第二章 毒源采集、纯化及CMV CP基因序列克隆 | 第30-42页 |
| 1. 材料与方法 | 第30-37页 |
| 1.1 实验材料 | 第30-31页 |
| 1.1.1 毒源及植物材料 | 第30-31页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第31页 |
| 1.2 实验方法 | 第31-37页 |
| 1.2.1 病样采集 | 第31页 |
| 1.2.2 印记酶联免疫吸附法(dot-ELISA)鉴定病毒种类 | 第31-32页 |
| 1.2.3 病毒单斑分离 | 第32页 |
| 1.2.4 毒源保存 | 第32页 |
| 1.2.5 CMV分离物总RNA的提取及RT-PCR | 第32-34页 |
| 1.2.5.1 植物总RNA提取 | 第32-33页 |
| 1.2.5.2 RNA质量和浓度检测 | 第33页 |
| 1.2.5.3 RNA反转录为cDNA | 第33-34页 |
| 1.2.6 引物设计 | 第34页 |
| 1.2.7 CMV CP基因PCR扩增 | 第34-35页 |
| 1.2.8 扩增产物电泳检测 | 第35页 |
| 1.2.9 PCR产物回收 | 第35-36页 |
| 1.2.10 回收产物连接T载体并转化大肠杆菌DH5α | 第36页 |
| 1.2.11 CMV CP基因序列分析 | 第36-37页 |
| 2. 结果与分析 | 第37-41页 |
| 2.1 田间采集油菜病毒病的症状及病毒种类检测 | 第37-38页 |
| 2.2 病毒纯化检测结果 | 第38-39页 |
| 2.3 CMV株系核酸遗传变异分析 | 第39-41页 |
| 2.3.1 RNA质量检测 | 第39-40页 |
| 2.3.2 CMV CP基因PCR扩增产物电泳分析 | 第40页 |
| 2.3.3 CMV CP基因核苷酸序列同源性遗传进化树分析 | 第40-41页 |
| 3. 讨论 | 第41-42页 |
| 第三章 BnSGS3基因克隆及序列分析 | 第42-52页 |
| 1. 材料与方法 | 第42-44页 |
| 1.1 实验材料 | 第42页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第42页 |
| 1.1.2 常用试剂 | 第42页 |
| 1.2 试验方法 | 第42-44页 |
| 1.2.1 DNA提取 | 第42-43页 |
| 1.2.2 引物设计 | 第43页 |
| 1.2.3 PCR扩增 | 第43-44页 |
| 1.2.4 序列分析 | 第44页 |
| 2. 实验结果 | 第44-50页 |
| 2.1 BnSGS3基因内含子鉴定 | 第44-45页 |
| 2.2 不同寄主SGS3基因核苷酸序列比对 | 第45-46页 |
| 2.3 BnSGS3蛋白结构和特点 | 第46-49页 |
| 2.4 BnSGS3基因启动子预测 | 第49页 |
| 2.5 BnSGS3基因CpG岛预测 | 第49-50页 |
| 3. 讨论 | 第50-52页 |
| 第四章 BnSGS3基因在油菜不同组织表达量和拷贝数检测及对不同病毒的抗性鉴定 | 第52-63页 |
| 1. 材料与方法 | 第52-57页 |
| 1.1 试验材料 | 第52-53页 |
| 1.1.1 供试油菜的栽培 | 第52页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第52-53页 |
| 1.2 试验方法 | 第53-57页 |
| 1.2.1 RNA提取及RT-PCR | 第53页 |
| 1.2.2 RNA质量和浓度检测 | 第53页 |
| 1.2.3 qRT-PCR法检测BnSGS3在油菜不同组织的表达量 | 第53-54页 |
| 1.2.4 PCR扩增 | 第54页 |
| 1.2.5 质粒构建并转化大肠杆菌DH5 α | 第54页 |
| 1.2.6 质粒DNA提取 | 第54-55页 |
| 1.2.7 标准品制作 | 第55页 |
| 1.2.8 qRT-PCR法检测BnSGS3拷贝数 | 第55-56页 |
| 1.2.9 病毒接种油菜中双六号品种 | 第56页 |
| 1.2.10 病害调查 | 第56页 |
| 1.2.11 数据统计 | 第56-57页 |
| 2. 试验结果 | 第57-61页 |
| 2.1 BnSGS3在油菜不同组织的相对表达量检测 | 第57页 |
| 2.2 BnSGS3基因在油菜中的拷贝数 | 第57-60页 |
| 2.3 油菜抗病性鉴定 | 第60-61页 |
| 3. 讨论 | 第61-63页 |
| 第五章 BnSGS3遗传转化拟南芥sgs3-14突变体 | 第63-72页 |
| 1. 材料与方法 | 第63-67页 |
| 1.1 试验材料 | 第63-64页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第63页 |
| 1.1.2 菌株 | 第63-64页 |
| 1.1.3 质粒 | 第64页 |
| 1.1.4 病毒来源 | 第64页 |
| 1.1.5 主要试剂 | 第64页 |
| 1.2 方法 | 第64-67页 |
| 1.2.1 农杆菌感受态的制备 | 第64-65页 |
| 1.2.2 质粒电击转化GV3101 | 第65页 |
| 1.2.3 质粒DNA提取 | 第65页 |
| 1.2.4 质粒DNA转化大肠杆菌 | 第65页 |
| 1.2.5 酶切鉴定阳性克隆 | 第65-66页 |
| 1.2.6 BnSGS3-Ov转化sgs3-14拟南芥突变体 | 第66页 |
| 1.2.7 除草剂筛选T0代转基因拟南芥 | 第66页 |
| 1.2.8 T0代BnSGS3-Ov转基因拟南芥PCR检测 | 第66-67页 |
| 1.2.9 拟南芥发病情况调查 | 第67页 |
| 2. 结果与分析 | 第67-71页 |
| 2.1 农杆菌转化子菌液PCR检测 | 第67-68页 |
| 2.2 重转大肠杆菌菌液中质粒DNA的酶切鉴定 | 第68页 |
| 2.3 T0代转基因拟南芥的除草剂筛选 | 第68-69页 |
| 2.4 T0代转基因拟南芥的PCR鉴定 | 第69-70页 |
| 2.5 转基因拟南芥抗病性鉴定 | 第70-71页 |
| 3. 讨论 | 第71-72页 |
| 第六章 BnSGS3转基因油菜农艺性状调查及BnSGS3表达量与病毒积累量关系研究 | 第72-96页 |
| 1. 材料与方法 | 第73-79页 |
| 1.1 材料 | 第73-74页 |
| 1.1.1 植物材料 | 第73页 |
| 1.1.2 质粒 | 第73页 |
| 1.1.3 病毒来源 | 第73页 |
| 1.1.3 主要生物学试剂 | 第73-74页 |
| 1.2 试验方法 | 第74-79页 |
| 1.2.1 浸花法转化甘蓝型油菜 | 第74页 |
| 1.2.1.1 菌液处理 | 第74页 |
| 1.2.1.2 转化方法 | 第74页 |
| 1.2.2 组织培养法转化甘蓝型油菜 | 第74-75页 |
| 1.2.3 转基因油菜筛选 | 第75-76页 |
| 1.2.4 转基因油菜基因组DNA提取(CTAB法) | 第76页 |
| 1.2.5 幼苗移栽 | 第76页 |
| 1.2.6 转基因油菜PCR检测 | 第76页 |
| 1.2.7 转基因油菜花粉粒活性检测 | 第76页 |
| 1.2.8 转基因油菜生长期农艺性状调查 | 第76-77页 |
| 1.2.9 病毒提纯 | 第77页 |
| 1.2.10 提纯病毒的浓度测定 | 第77-78页 |
| 1.2.11 病毒接种 | 第78页 |
| 1.2.12 转基因油菜单株BnSGS3表达量检测 | 第78页 |
| 1.2.13 病毒诱导BnSGS3基因表达情况检测 | 第78页 |
| 1.2.14 病毒质粒标准品制作 | 第78-79页 |
| 1.2.15 qRT-PCR法检测3种病毒积累情况 | 第79页 |
| 2. 结果与分析 | 第79-93页 |
| 2.1 BnSGS3基因的遗传转化 | 第79-81页 |
| 2.2 转基因油菜筛选 | 第81-82页 |
| 2.3 转基因油菜表型观察 | 第82-86页 |
| 2.3.1 转基因油菜T0代株系花粉粒活性观察 | 第82-83页 |
| 2.3.2 花朵观察 | 第83-84页 |
| 2.3.3 T0代转基因油菜农艺性状调查 | 第84-86页 |
| 2.4 BnSGS3在转基因油菜单株的表达量检测 | 第86页 |
| 2.5 提纯病毒浓度测定 | 第86页 |
| 2.6 病毒接种T0代转基因和非转基因油菜后BnSGS3表达量变化 | 第86-88页 |
| 2.7 病毒积累量变化 | 第88-93页 |
| 2.7.1 标准曲线的制作 | 第88-89页 |
| 2.7.2 BnSGS3-Ov油菜中病毒积累量的变化 | 第89页 |
| 2.7.3 非转基因油菜中病毒积累量的变化 | 第89页 |
| 2.7.4 BnSGS3-Si油菜中病毒积累量的变化 | 第89-93页 |
| 2.8 病毒积累量与BNSGS3表达量的关系分析 | 第93页 |
| 3. 讨论 | 第93-96页 |
| 3.1 两种转基因方法的优缺点分析 | 第93-94页 |
| 3.2 病毒积累量和SGS3基因表达量的关系分析 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-109页 |
| 附录1 主要试剂及溶液的配制 | 第109-112页 |
| 附录2 侵染油菜的CMV CP基因核苷酸序列 | 第112-113页 |
| 附录3 质粒图谱 | 第113-114页 |
| 附录4 在读期间论文发表情况 | 第114-115页 |
| 致谢 | 第115-117页 |
