| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 PEAR技术制备修饰性反义寡核昔酸 | 第12-50页 |
| 1 前言 | 第12-23页 |
| 1.1 反义寡核苷酸 | 第12-17页 |
| 1.1.1 反义寡核苷酸的定义 | 第12页 |
| 1.1.2 反义寡核苷酸的化学修饰 | 第12-17页 |
| 1.1.2.1 磷酸骨架修饰 | 第13-14页 |
| 1.1.2.2 碱基修饰 | 第14-16页 |
| 1.1.2.3 糖环修饰 | 第16-17页 |
| 1.2 其他类型寡核苷酸 | 第17-20页 |
| 1.2.1 siRNA | 第17-18页 |
| 1.2.2 三股螺旋寡核苷酸 | 第18-19页 |
| 1.2.3 CpG寡核苷酸 | 第19页 |
| 1.2.4 核酸配合体 | 第19-20页 |
| 1.3 寡核苷酸扩增技术 | 第20页 |
| 1.4 寡核苷酸大规模制备技术存在的问题 | 第20-21页 |
| 1.5 PEAR技术 | 第21-22页 |
| 1.7 核酸质谱分析技术 | 第22-23页 |
| 2 研究内容和意义 | 第23-24页 |
| 3 材料和方法 | 第24-28页 |
| 3.1 实验材料 | 第24-25页 |
| 3.2 实验方法 | 第25-28页 |
| 3.2.1 PEAR反应 | 第25-26页 |
| 3.2.1.1 PEAR反应体系 | 第25-26页 |
| 3.2.1.2 PEAR反应程序 | 第26页 |
| 3.2.2 PEAR产物PAGE电泳检测 | 第26页 |
| 3.2.3 PEAR产物质谱检测 | 第26-28页 |
| 3.2.3.1 PEAR产物纯化 | 第26页 |
| 3.2.3.2 PEAR产物的完全酶切 | 第26-27页 |
| 3.2.3.3 PEAR酶切产物质谱分析 | 第27-28页 |
| 4 结果和讨论 | 第28-47页 |
| 4.1 结果 | 第28-45页 |
| 4.1.1 PEAR扩增修饰性寡核苷酸 | 第28-36页 |
| 4.1.1.1 PEAR反应体系中Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶及限制性内切酶PspGI浓度的优化 | 第28页 |
| 4.1.1.2 利用Phusion DNA聚合酶,PEAR扩增2'-F-dNTPs修饰的寡核苷酸 | 第28-31页 |
| 4.1.1.3 PEAR产物作为“种子”进行二轮扩增 | 第31-32页 |
| 4.1.1.4 利用KOD DNA聚合酶扩增2'-F-dNTPs修饰寡核苷酸 | 第32-34页 |
| 4.1.1.5 利用KOD DNA聚合酶,PEAR扩增dTTPαS修饰和2 '-F-dATP/dNTPaSs混合修饰寡核苷酸 | 第34-36页 |
| 4.1.2 PEAR产物组分的质谱检测 | 第36-45页 |
| 4.2 PEAR技术优势 | 第45-46页 |
| 4.3 讨论 | 第46-47页 |
| 5 结论 | 第47-50页 |
| 第二章 移码突变恢复相关研究 | 第50-76页 |
| 1 前言 | 第50-57页 |
| 1.2 定点诱变 | 第50-54页 |
| 1.2.1 定点诱变的概述 | 第50-51页 |
| 1.2.2 定点诱变的方法 | 第51-52页 |
| 1.2.3 PCR介导的定点诱变 | 第52-54页 |
| 1.3 遗传重组 | 第54-57页 |
| 1.3.1 同源重组 | 第55页 |
| 1.3.2 位点特异性重组 | 第55-56页 |
| 1.3.3 转座重组 | 第56页 |
| 1.3.4 寡核苷酸介导的遗传重组 | 第56-57页 |
| 1.4 回复突变 | 第57页 |
| 2 研究内容和意义 | 第57-58页 |
| 3 材料和方法 | 第58-65页 |
| 3.1 实验材料 | 第58页 |
| 3.2 实验方法 | 第58-65页 |
| 3.2.1 质粒pBR322 β-内酰胺酶基因移码突变的制备 | 第58-63页 |
| 3.2.1.1 质粒pBR322转化E.coli JM109感受态细胞及质粒的提取 | 第58-59页 |
| 3.2.1.2 重叠延伸PCR | 第59-61页 |
| 3.2.1.3 PCR产物的双酶切 | 第61页 |
| 3.2.1.4 pBR322的双酶切 | 第61-62页 |
| 3.2.1.5 酶切产物的连接 | 第62页 |
| 3.2.1.6 pBR322/Amp转化E.coliJM109感受态细胞 | 第62-63页 |
| 3.2.1.7 测序 | 第63页 |
| 3.2.2 寡核苷酸介导的β-内酰胺酶基因功能恢复 | 第63-64页 |
| 3.2.2.1 E.coli JM109/pBR322/Amp~-感受态细胞的制备 | 第63页 |
| 3.2.2.2 寡核苷酸转化感受态E.coli JM109/pBR322/Amp~- | 第63-64页 |
| 3.2.2.3 统计数据,计算抗性恢复率 | 第64页 |
| 3.2.2.4 培养纯化测序 | 第64页 |
| 3.2.3 抗性自发恢复菌株测序 | 第64-65页 |
| 4 结果与讨论 | 第65-76页 |
| 4.1 结果与分析 | 第65-73页 |
| 4.1.1 E.coli JM109/pBR322/Amp~-的获得 | 第65-69页 |
| 4.1.1.1 E.coli JM109/pBR322的获得 | 第65-66页 |
| 4.1.1.2 重叠延伸PCR | 第66-67页 |
| 4.1.1.3 质粒pBR322/Amp~-的构建 | 第67-68页 |
| 4.1.1.4 pBR322/Amp~-测序 | 第68-69页 |
| 4.1.2 寡核苷酸介导的β-内酰胺酶活性的恢复 | 第69-71页 |
| 4.1.3 自然条件下β-内酰胺酶活性的恢复 | 第71-73页 |
| 4.2 讨论 | 第73-76页 |
| 4.2.1 寡核苷酸介导的同源重组 | 第73-75页 |
| 4.2.2 移码突变恢复 | 第75-76页 |
| 5 结论 | 第76页 |
| 参考文献 | 第76-85页 |
| 附录 | 第85-96页 |
| 附录Ⅰ 常用溶液配制 | 第85-89页 |
| 附录Ⅱ 主要实验仪器 | 第89-90页 |
| 附录Ⅲ 常规实验步骤 | 第90-93页 |
| 附录Ⅳ 寡核苷酸序列汇总 | 第93-94页 |
| 附录Ⅴ DNA及蛋白质序列 | 第94-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 个人简历 | 第97页 |
| 发表的学术论文 | 第97页 |
