| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第1章 绪论 | 第11-21页 |
| 1.1 海藻糖的特性 | 第11页 |
| 1.2 海藻糖的应用 | 第11-13页 |
| 1.3 海藻糖的主要制备方法 | 第13-14页 |
| 1.3.1 双酶法制备海藻糖 | 第13页 |
| 1.3.2 单酶法制备海藻糖 | 第13-14页 |
| 1.4 海藻糖合酶基因工程方面的研究 | 第14页 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌表达系统 | 第14-16页 |
| 1.5.1 枯草芽孢杆菌概述 | 第14-15页 |
| 1.5.2 枯草芽孢杆菌表达系统的优点 | 第15页 |
| 1.5.3 枯草芽孢杆菌表达系统的缺点 | 第15-16页 |
| 1.5.4 枯草芽孢杆菌的特殊性 | 第16页 |
| 1.6 枯草芽孢杆菌的调控表达启动子 | 第16-18页 |
| 1.6.1 常用枯草芽孢杆菌调控表达启动子 | 第16-17页 |
| 1.6.2 麦芽糖诱导型启动子 | 第17-18页 |
| 1.7 本课题的立题背景和研究内容 | 第18-21页 |
| 1.7.1 立题背景 | 第18页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第18-21页 |
| 第2章 重组菌B.subtilis WB800n（P_(glv)-pHT01- treS）的构建与表达 | 第21-39页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.2.1 菌种与表达质粒 | 第21页 |
| 2.2.2 主要培养基 | 第21页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第22页 |
| 2.2.5 主要溶液配置 | 第22-23页 |
| 2.3 主要方法 | 第23-29页 |
| 2.3.1 麦芽糖诱导型重组质粒P_(glv)-pHT01-treS的构建 | 第23-29页 |
| 2.3.1.1 枯草芽孢杆菌168和恶臭假单胞杆菌KT2440基因组的提取 | 第24页 |
| 2.3.1.2 大肠杆菌感受细胞的制备与转化 | 第24-25页 |
| 2.3.1.3 引物设计与目的片段的扩增 | 第25页 |
| 2.3.1.4 基因片段的扩增 | 第25-26页 |
| 2.3.1.5 基因片段的重叠 | 第26-27页 |
| 2.3.1.6 片段P_(glv)-treS和质粒pHT01的双酶切 | 第27-28页 |
| 2.3.1.7 片段P_(glv)-treS和质粒pHT01的连接 | 第28-29页 |
| 2.3.2 重组菌B.subtilis WB800n（P_(glv)-pHT01-treS）的构建 | 第29页 |
| 2.3.3 重组菌海藻糖合酶的表达验证 | 第29页 |
| 2.3.4 海藻糖合酶的酶活力分析 | 第29页 |
| 2.4 结果分析 | 第29-37页 |
| 2.4.1 枯草芽孢杆菌168和恶臭假单胞杆菌KT2440基因组的提取 | 第30-31页 |
| 2.4.2 P_(glv)-1、P_(glv)-2 和treS三个片段的扩增 | 第31-32页 |
| 2.4.3 P_(glv)-1、P_(glv)-2 和treS三个片段的重叠 | 第32页 |
| 2.4.4 质粒P_(glv)-pHT01-treS的构建 | 第32-33页 |
| 2.4.5 麦芽糖启动子和海藻糖合酶基因的测序 | 第33-34页 |
| 2.4.6 重组枯草芽孢杆菌的菌落PCR和提取质粒验证 | 第34-35页 |
| 2.4.7 SDS-PAGE蛋白电泳分析 | 第35-36页 |
| 2.4.8 HPLC液相色谱分析 | 第36-37页 |
| 2.5 本章小结 | 第37-39页 |
| 第3章 重组菌B.subtilis WB800n（ΔamyE，P_(glv)-pHT01- treS）的构建与表达 | 第39-49页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 实验用材 | 第39-40页 |
| 3.2.1 菌种与表达质粒 | 第39页 |
| 3.2.2 主要培养基的制备 | 第39页 |
| 3.2.3 主要实验试剂 | 第39页 |
| 3.2.4 主要实验仪器 | 第39-40页 |
| 3.2.5 主要溶液配置 | 第40页 |
| 3.3 主要实验方法 | 第40-43页 |
| 3.3.1 单交叉互换法敲除 α-淀粉酶基因 | 第40-43页 |
| 3.3.1.1 同源臂amyE-1 和卡那霉素抗性基因kanr的扩增与重叠 | 第41-42页 |
| 3.3.1.2 amyE1kanr基因片段的浓缩 | 第42页 |
| 3.3.1.3 amyE1kanr基因片段的电转化 | 第42页 |
| 3.3.1.4 透明圈平板法验证阳性克隆子 | 第42-43页 |
| 3.3.2 重组菌B.subtilis WB800n（ΔamyE,P_(glv)-pHT01-treS）的制备 | 第43页 |
| 3.3.2.1 质粒P_(glv)-pHT01-treS转化到B.subtilis WB800n（ΔamyE） | 第43页 |
| 3.3.2.2 阳性克隆子的验证 | 第43页 |
| 3.3.3 重组菌海藻糖合酶的酶活力验证 | 第43页 |
| 3.4 结果分析 | 第43-47页 |
| 3.4.1 重组菌B.subtilis WB800n（ΔamyE）的构建 | 第43-45页 |
| 3.4.2 重组菌B.subtilis WB800n（ΔamyE,P_(glv)-pHT01-treS）的构建 | 第45-46页 |
| 3.4.3 重组菌海藻糖合酶的酶活力分析 | 第46-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-49页 |
| 第4章 麦芽糖诱导重组枯草芽孢杆菌发酵条件的研究 | 第49-59页 |
| 4.1 引言 | 第49页 |
| 4.2 实验用材 | 第49页 |
| 4.2.1 实验菌种 | 第49页 |
| 4.2.2 培养基的配置 | 第49页 |
| 4.2.3 实验试剂 | 第49页 |
| 4.2.4 实验仪器 | 第49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-50页 |
| 4.3.1 实验菌种的活化 | 第49-50页 |
| 4.3.2 种子培养液的培养 | 第50页 |
| 4.3.3 发酵培养方法 | 第50页 |
| 4.4 实验结果分析 | 第50-56页 |
| 4.4.1 重组菌生长曲线的测定 | 第50-51页 |
| 4.4.2 溶菌酶破壁浓度的影响 | 第51-52页 |
| 4.4.3 麦芽糖浓度的影响 | 第52-53页 |
| 4.4.4 麦芽糖诱导时机和温度的影响 | 第53-54页 |
| 4.4.5 海藻糖合酶酶活随诱导时间的变化影响 | 第54-55页 |
| 4.4.6 海藻糖合酶蛋白表达分析 | 第55-56页 |
| 4.5 本章小结 | 第56-59页 |
| 第5章 结论与展望 | 第59-61页 |
| 5.1 结论 | 第59页 |
| 5.2 展望 | 第59-61页 |
| 参考文献 | 第61-69页 |
| 致谢 | 第69-71页 |
| 在学期间主要研究成果 | 第71页 |
