| 中文摘要 | 第4-7页 |
| 英文摘要 | 第7页 |
| 第一章、引言 | 第13-25页 |
| 一、细胞骨架及其生物学功能 | 第13-15页 |
| 二、细胞内物质运输简介 | 第15-16页 |
| 三、驱动蛋白超家族简介 | 第16-23页 |
| 四、本研究的基础、目的和意义 | 第23-25页 |
| 第二章、NtKrp基因的克隆及生物信息学分析 | 第25-47页 |
| 一、材料与方法 | 第25-27页 |
| (一)、药品试剂 | 第25-27页 |
| (二)、植物材料及其种植 | 第27页 |
| 二、基因的克隆： | 第27-39页 |
| (一)、烟草叶总RNA的提取 | 第27页 |
| (二)、该差异片段的检测 | 第27-29页 |
| (三)、3’RACE实验 | 第29-31页 |
| (四)、5’RACE反转录 | 第31-34页 |
| (五)、目标片段的分离和纯化 | 第34-35页 |
| (六)、TA克隆 | 第35页 |
| (七)、大肠杆菌DH5α感受态的制备 | 第35-36页 |
| (八)、连接产物的转化 | 第36页 |
| (九)、转化菌落的鉴定 | 第36-38页 |
| (十)、阳性克隆质粒的提取 | 第38页 |
| (十一)、质粒酶切鉴定 | 第38-39页 |
| 三、生物信息学分析 | 第39页 |
| 四、结果和讨论 | 第39-47页 |
| 第三章、利用单胚RT-PCR技术对植物胚胎发育过程中基因表达动态分析 | 第47-56页 |
| 一、前言 | 第47页 |
| 二、材料和方法 | 第47-51页 |
| (一)、药品试剂 | 第47-49页 |
| (二)、植物材料 | 第49页 |
| (三)、胚胎的分离 | 第49页 |
| (四)、胚胎的裂解 | 第49-50页 |
| (五)、DNase Ⅰ处理 | 第50页 |
| (六)、反转录 | 第50页 |
| (七)、PCR扩增 | 第50-51页 |
| (八)、电泳及结果分析 | 第51页 |
| 三、结果和讨论 | 第51-56页 |
| 第四章、NtKrp基因表达模式的分析 | 第56-79页 |
| 一、材料与方法 | 第56-58页 |
| (一)、药品试剂 | 第56-58页 |
| (二)、植物材料及其种植 | 第58页 |
| 二、烟草各组织的转录本检测 | 第58页 |
| 三、烟草胚胎发生过程中转录本检测 | 第58页 |
| 四、多克隆抗体的制备及Western blotting | 第58-66页 |
| (一)、蛋白特异序列的高保真克隆 | 第58-60页 |
| (二)、原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化 | 第60-61页 |
| (三)、重组载体转入表达宿主BL21(DE3)并表达 | 第61页 |
| (四)、诱导蛋白的纯化 | 第61-62页 |
| (五)、SDS-PAGE电泳检测 | 第62-63页 |
| (六)、实验兔的检测 | 第63-65页 |
| (七)、实验兔免疫 | 第65页 |
| (八)、烟草成熟组织NtKrp蛋白分布分析 | 第65-66页 |
| 五、各成熟组织及胚胎的原位杂交实验 | 第66-72页 |
| (一)、实验材料的制备 | 第66-67页 |
| (二)、探针的制备 | 第67-68页 |
| (三)、原位杂交实验 | 第68-72页 |
| 六、结果及讨论 | 第72-79页 |
| 第五章：NtKrp蛋白生化活性的分析 | 第79-97页 |
| 一、前言 | 第79-81页 |
| 二、材料与方法 | 第81-83页 |
| (一)、样品与试剂 | 第81页 |
| (二)、仪器与设备 | 第81页 |
| (三)、量热实验 | 第81-83页 |
| (四)、酶偶联分光光度法 | 第83页 |
| 三、实验结果 | 第83-88页 |
| (一)、量热曲线 | 第83-84页 |
| (二)、Kinesin微管依赖ATP酶活性的热力学 | 第84-85页 |
| (三)、Kinesin微管依赖ATP酶活性的动力学 | 第85-88页 |
| 四、酶联紫外分光法测定ATP酶活性 | 第88-91页 |
| 五、酶联紫外分光法测定尾部蛋白对马达区蛋白ATPase活性的抑制作用 | 第91-93页 |
| 六、天然牛脑微管蛋白的提取、荧光标记及体外聚合 | 第93-94页 |
| (一)、天然牛脑微管蛋白的提取 | 第93页 |
| (二)、天然牛脑微管蛋白的标记、纯化和聚合 | 第93-94页 |
| 七、讨论 | 第94-97页 |
| 第六章：NtKrp蛋白细胞定位与分析、转基因分析 | 第97-124页 |
| 一、细胞瞬时表达载体构建及检测 | 第97-104页 |
| (一)、利用高保真PCR克隆所需目标片段 | 第97-98页 |
| (二)、目标片段的分离和纯化 | 第98页 |
| (三)、TA克隆 | 第98-99页 |
| (四)、连接产物的转化 | 第99-100页 |
| (五)、转化菌落的鉴定 | 第100-101页 |
| (六)、阳性克隆质粒的提取 | 第101页 |
| (七)、质粒酶切鉴定 | 第101-102页 |
| (八)、将正确的插入片段亚克隆至真核瞬时表达载体 | 第102-104页 |
| 二、原核表达检测 | 第104-107页 |
| (一)、大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备 | 第104-105页 |
| (二)、原核表达载体的转化 | 第105页 |
| (三)、原核表达目标融合蛋白并检测荧光 | 第105-106页 |
| (四)、诱导蛋白的检测 | 第106页 |
| (五)、SDS-PAGE电泳检测 | 第106-107页 |
| 三、洋葱表皮细胞转化和荧光观察 | 第107-109页 |
| (一)、金粉制备 | 第108页 |
| (二)、金粉包被 | 第108页 |
| (三)、洋葱表皮细胞转化 | 第108页 |
| (四)、荧光观察 | 第108页 |
| (五)、苏氨酸点突变瞬时表达载体构建及检测 | 第108-109页 |
| 四、转基因载体的构建及烟草转化 | 第109-112页 |
| (一)、转基因载体的构建 | 第109页 |
| (二)、农杆菌电击感受态的制备及电击 | 第109-110页 |
| (三)、烟草无菌叶的制备 | 第110-111页 |
| (四)、农杆菌的制备 | 第111页 |
| (五)、烟草无菌叶和农杆菌的共培养 | 第111页 |
| (六)、烟草转化叶片的筛选 | 第111页 |
| (七)、烟草抗性苗的切取和生根筛选 | 第111-112页 |
| (八)、反义转基因植株初步分析 | 第112页 |
| 五、结果和讨论 | 第112-124页 |
| 第七章：总讨论 | 第124-128页 |
| 参考文献 | 第128-138页 |
| 在读期间发表与整理的论文 | 第138-139页 |
| 致谢 | 第139页 |
