| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 英文缩写表 | 第9-20页 |
| 第1章 前言 | 第20-52页 |
| 1.1 低温对植物的影响 | 第20-28页 |
| 1.1.1 低温对细胞膜的影响 | 第21-23页 |
| 1.1.2 低温对光合作用的影响 | 第23-25页 |
| 1.1.3 低温对渗透调节物质的影响 | 第25-28页 |
| 1.1.3.1 脯氨酸对植物抗寒性的影响 | 第25-26页 |
| 1.1.3.2 可溶性糖对植物抗寒性的影响 | 第26-27页 |
| 1.1.3.3 可溶性蛋白对植物抗寒性的影响 | 第27-28页 |
| 1.2 柱花草生物技术的研究进展 | 第28-35页 |
| 1.2.1 柱花草组织培养的研究 | 第28-31页 |
| 1.2.1.1 外植体的选择 | 第29页 |
| 1.2.1.2 激素比例配比 | 第29-30页 |
| 1.2.1.3 种类及品种的选择 | 第30-31页 |
| 1.2.2 柱花草的抗寒性研究 | 第31-34页 |
| 1.2.2.1 抗寒的生理生化研究 | 第31-32页 |
| 1.2.2.2 抗寒的分子水平研究 | 第32-33页 |
| 1.2.2.3 抗寒品种的选育 | 第33-34页 |
| 1.2.3 柱花草的基因及其功能研究 | 第34-35页 |
| 1.2.3.1 柱花草基因的克隆 | 第34页 |
| 1.2.3.2 柱花草基因功能的研究 | 第34-35页 |
| 1.2.4 面临的问题及研究前景 | 第35页 |
| 1.3 转录组测序技术的研究进展 | 第35-40页 |
| 1.3.1 转录组概述 | 第35-36页 |
| 1.3.2 转录组测序概述 | 第36-38页 |
| 1.3.3 转录组测序在植物中的应用 | 第38-40页 |
| 1.3.3.1 转录组测序在有参考基因组植物中的应用 | 第39-40页 |
| 1.3.3.2 转录组测序在无参考基因组植物中的应用 | 第40页 |
| 1.4 植物NAC转录因子的研究进展 | 第40-45页 |
| 1.4.1 NAC转录因子蛋白的结构特点 | 第41-42页 |
| 1.4.2 NAC转录因子的分类 | 第42-43页 |
| 1.4.3 NAC转录因子在植物中的功能研究 | 第43-45页 |
| 1.4.3.1 NAC转录因子在植物生长发育中的作用 | 第43-44页 |
| 1.4.3.2 NAC转录因子在植物非生物胁迫中的作用 | 第44-45页 |
| 1.5 植物GH3基因的研究进展 | 第45-49页 |
| 1.5.1 GH3基因的蛋白结构与分类 | 第46-48页 |
| 1.5.2 GH3蛋白在植物中的功能研究 | 第48-49页 |
| 1.6 研究的目的与意义 | 第49-51页 |
| 1.7 研究的技术路线 | 第51-52页 |
| 第2章 细茎柱花草 89-1 的抗寒性鉴定 | 第52-65页 |
| 2.1 引言 | 第52页 |
| 2.2 材料与方法 | 第52-54页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第52页 |
| 2.2.2 仪器设备 | 第52-53页 |
| 2.2.3 试剂 | 第53页 |
| 2.2.4 主要试剂配制 | 第53-54页 |
| 2.2.5 主要数据处理软件 | 第54页 |
| 2.3 实验方法 | 第54-58页 |
| 2.3.1 植物材料的低温处理 | 第54页 |
| 2.3.2 相对电导率的测定 | 第54页 |
| 2.3.3 丙二醛的测定 | 第54-55页 |
| 2.3.4 脯氨酸的测定 | 第55-56页 |
| 2.3.4.1 标准曲线的绘制 | 第55页 |
| 2.3.4.2 样品的测定 | 第55-56页 |
| 2.3.5 可溶性糖的测定 | 第56-57页 |
| 2.3.5.1 标准曲线的绘制 | 第56页 |
| 2.3.5.2 样品的测定 | 第56-57页 |
| 2.3.6 可溶性蛋白的测定 | 第57-58页 |
| 2.3.6.1 标准曲线的绘制 | 第57页 |
| 2.3.6.2 样品的测定 | 第57-58页 |
| 2.4 结果与分析 | 第58-63页 |
| 2.4.1 低温胁迫下相对电导率的变化 | 第58-59页 |
| 2.4.2 低温胁迫下丙二醛含量的变化 | 第59-60页 |
| 2.4.3 低温胁迫下脯氨酸含量的变化 | 第60-61页 |
| 2.4.4 低温胁迫下可溶性糖含量的变化 | 第61-62页 |
| 2.4.5 低温胁迫下可溶性蛋白含量的变化 | 第62-63页 |
| 2.5 讨论 | 第63-65页 |
| 第3章 低温胁迫下细茎柱花草转录组的De novo组装和功能注释 | 第65-92页 |
| 3.1 引言 | 第65-66页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第66-70页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第66-67页 |
| 3.2.2 实验材料的处理 | 第67页 |
| 3.2.3 实验方法 | 第67-70页 |
| 3.2.3.1 实验流程 | 第67-68页 |
| 3.2.3.2 信息分析流程 | 第68-70页 |
| 3.3 结果与分析 | 第70-88页 |
| 3.3.1 转录组测序与序列组装 | 第70-75页 |
| 3.3.2 基因功能注释与分类 | 第75-79页 |
| 3.3.3 低温胁迫下差异基因表达分析 | 第79-85页 |
| 3.3.3.1 差异表达基因GO统计 | 第80-83页 |
| 3.3.3.2 差异表达基因KEGG通路分析 | 第83-85页 |
| 3.3.4 SSR开发与引物设计 | 第85页 |
| 3.3.5 低温胁迫下转录因子分析 | 第85-88页 |
| 3.4 讨论 | 第88-90页 |
| 3.4.1 Illumina测序序列的组装及功能注释与分类 | 第88-89页 |
| 3.4.2 不饱和脂肪酸与柱花草抗寒性 | 第89页 |
| 3.4.3 转录因子与细茎柱花草的抗寒性 | 第89-90页 |
| 3.5 本章结论 | 第90-92页 |
| 第4章 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因的克隆及表达分析 | 第92-137页 |
| 4.1 引言 | 第92页 |
| 4.2 材料与方法 | 第92-96页 |
| 4.2.1 植物材料 | 第92-93页 |
| 4.2.2 菌种与载体 | 第93页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第93页 |
| 4.2.4 试剂及配制 | 第93-96页 |
| 4.2.4.1 主要试剂 | 第93-94页 |
| 4.2.4.2 主要试剂配制 | 第94-96页 |
| 4.2.5 主要软件 | 第96页 |
| 4.3 实验方法 | 第96-110页 |
| 4.3.1 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因的CDS序列克隆 | 第96-104页 |
| 4.3.1.1 柱花草RNA的提取 | 第96-97页 |
| 4.3.1.2 cDNA第一链合成 | 第97页 |
| 4.3.1.3 柱花草DNA的提取 | 第97-98页 |
| 4.3.1.4 hi TAIL-PCR扩增 | 第98-100页 |
| 4.3.1.5 PCR产物的回收 | 第100-101页 |
| 4.3.1.6 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因CDS全长序列的PCR扩增 | 第101页 |
| 4.3.1.7 T-载体连接目的基因 | 第101-102页 |
| 4.3.1.8 大肠杆菌感受态的制备 | 第102页 |
| 4.3.1.9 大肠杆菌的转化 | 第102页 |
| 4.3.1.10 重组子的鉴定 | 第102-103页 |
| 4.3.1.11 质粒提取 | 第103-104页 |
| 4.3.1.12 重组质粒的双酶切鉴定 | 第104页 |
| 4.3.1.13 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因DNA全长序列克隆 | 第104页 |
| 4.3.2 酵母单杂交 | 第104-107页 |
| 4.3.2.1 酵母单杂交载体p GBKT7-SgNAC1和p GBKT7-SgNAC2的构建 | 第104-106页 |
| 4.3.2.2 酵母AH109感受态制备 | 第106页 |
| 4.3.2.3 酵母AH109的热激转化 | 第106-107页 |
| 4.3.2.3 转录活性分析 | 第107页 |
| 4.3.3 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因的表达模式分析 | 第107-109页 |
| 4.3.3.1 材料种植与处理 | 第107页 |
| 4.3.3.2 柱花草RNA提取 | 第107-108页 |
| 4.3.3.3 cDNA第一链的合成 | 第108页 |
| 4.3.3.4 qRT- PCR引物设计 | 第108页 |
| 4.3.3.5 qRT- PCR反应体系 | 第108-109页 |
| 4.3.3.6 qRT- PCR扩增程序 | 第109页 |
| 4.3.3.7 qRT- PCR数据分析 | 第109页 |
| 4.3.4 生物信息学分析 | 第109-110页 |
| 4.3.4.1 序列同源性分析 | 第109页 |
| 4.3.4.2 蛋白质基本理化性质分析 | 第109页 |
| 4.3.4.3 构建系统进化树 | 第109-110页 |
| 4.3.4.4 蛋白质结构分析 | 第110页 |
| 4.4 结果与分析 | 第110-133页 |
| 4.4.1 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因的克隆 | 第110-117页 |
| 4.4.1.1 SgNAC1基因的CDS序列克隆 | 第110-111页 |
| 4.4.1.2 SgNAC1基因的DNA序列克隆 | 第111-112页 |
| 4.4.1.3 SgNAC2基因的CDS序列克隆 | 第112-114页 |
| 4.4.1.4 SgNAC2基因的DNA序列克隆 | 第114-115页 |
| 4.4.1.5 SgGH3基因的CDS序列克隆 | 第115-116页 |
| 4.4.1.6 SgGH3基因的DNA序列克隆 | 第116页 |
| 4.4.1.7 pMD19-T-SgNAC1、p MD19-T SgNAC2和p MD19-T -SgGH3的构建 | 第116-117页 |
| 4.4.2 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3的生物信息学分析 | 第117-130页 |
| 4.4.2.1 氨基酸序列分析 | 第117-122页 |
| 4.4.2.2 蛋白质二级结构预测 | 第122-123页 |
| 4.4.2.3 蛋白质三级结构预测 | 第123-125页 |
| 4.4.2.4 系统进化分析 | 第125-127页 |
| 4.4.2.5 氨基酸的多重序列比较 | 第127-130页 |
| 4.4.3 SgNAC1和SgNAC2的转录激活活性鉴定 | 第130-131页 |
| 4.4.4 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3的表达分析 | 第131-133页 |
| 4.5 讨论 | 第133-137页 |
| 4.5.1 SgNAC1、SgNAC2与SgGH3基因CDS的克隆及氨基酸序列特征 | 第133-134页 |
| 4.5.2 转录因子的转录激活活性鉴定 | 第134-135页 |
| 4.5.3 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3对低温的响应 | 第135-137页 |
| 第5章 柱花草原生质体分离体系的建立及SgNAC1与SgNAC2的亚细胞定位 | 第137-161页 |
| 5.1 引言 | 第137-138页 |
| 5.2 材料与方法 | 第138-141页 |
| 5.2.1 植物材料 | 第138页 |
| 5.2.2 菌种和质粒 | 第138-139页 |
| 5.2.3 主要仪器及试剂 | 第139页 |
| 5.2.4 主要试剂及配制 | 第139-141页 |
| 5.2.6 主要软件 | 第141页 |
| 5.3 实验方法 | 第141-148页 |
| 5.3.1 材料培养 | 第141-142页 |
| 5.3.2 原生质体的分离 | 第142-144页 |
| 5.3.2.1 最佳酶解组合的选择 | 第143页 |
| 5.3.2.2 最佳酶解时间的选择 | 第143页 |
| 5.3.2.3 最佳渗透压稳定剂和质膜稳定剂的选择 | 第143-144页 |
| 5.3.3 原生质体的纯化 | 第144页 |
| 5.3.4 原生质体产量和活性测定 | 第144-145页 |
| 5.3.4.1 原生质体的产量测定 | 第144-145页 |
| 5.3.4.2 原生质体的活力测定 | 第145页 |
| 5.3.5 原生质体转化 | 第145-146页 |
| 5.3.5.1 载体说明 | 第145页 |
| 5.3.5.2 原生质体转化 | 第145-146页 |
| 5.3.6 显微镜观察与数据处理 | 第146页 |
| 5.3.6.1 显微镜的观察及使用方法 | 第146页 |
| 5.3.6.2 数据整理与分析 | 第146页 |
| 5.3.7 SgNAC1和SgNAC2基因的亚细胞定位载体构建 | 第146-148页 |
| 5.3.7.1 目的片段的克隆 | 第146页 |
| 5.3.7.2 PCR产物的回收 | 第146-147页 |
| 5.3.7.3 PCR产物的酶切与连接 | 第147-148页 |
| 5.3.7.4 重组质粒的鉴定 | 第148页 |
| 5.3.7.5 质粒的浓缩 | 第148页 |
| 5.4 结果与分析 | 第148-156页 |
| 5.4.1 柱花草原生质体分离体系的条件筛选 | 第149-152页 |
| 5.4.1.1 不同酶液配比对柱花草原生质分离的影响 | 第149页 |
| 5.4.1.2 不同酶解时间对原生质体产量和活力的影响 | 第149-150页 |
| 5.4.1.3 甘露醇和MES对原生质体产量和活力影响 | 第150-152页 |
| 5.4.2 SgNAC1和SgNAC2基因的亚细胞定位 | 第152-156页 |
| 5.4.2.1 SgNAC1和SgNAC2基因CDS序列的扩增 | 第152-153页 |
| 5.4.2.2 亚细胞定位载体构建 | 第153-154页 |
| 5.4.2.3 SgNAC1和SgNAC2的亚细胞定位 | 第154-156页 |
| 5.5 讨论 | 第156-160页 |
| 5.5.1 实验材料对柱花草原生质体分离的影响 | 第156-157页 |
| 5.5.2 酶液组合对柱花草原生质体分离的影响 | 第157-158页 |
| 5.5.3 酶解时间对柱花草原生质体分离的影响 | 第158页 |
| 5.5.4 渗透调节物对柱花草原生质体分离的影响 | 第158-159页 |
| 5.5.5 柱花草原生质体的瞬时转化 | 第159-160页 |
| 5.6 本章结论 | 第160-161页 |
| 第6章 细茎柱花草SgNAC1，SgNAC2和SgGH3基因的抗寒功能分析 | 第161-186页 |
| 6.1 序言 | 第161页 |
| 6.2 材料与方法 | 第161-165页 |
| 6.2.1 植物材料 | 第161-162页 |
| 6.2.2 菌种和质粒 | 第162页 |
| 6.2.3 仪器设备 | 第162-163页 |
| 6.2.4 主要试剂及配制 | 第163-165页 |
| 6.2.4.1 主要培养基配方 | 第163-164页 |
| 6.2.4.2 DNA提取试剂 | 第164页 |
| 6.2.4.3 生理测定所需试剂 | 第164页 |
| 6.2.4.4 其他试剂 | 第164-165页 |
| 6.3 实验方法 | 第165-169页 |
| 6.3.1 SgNAC1，SgNAC2和SgGH3基因过表达载体的构建 | 第165-166页 |
| 6.3.1.1 目的基因的克隆 | 第165-166页 |
| 6.3.1.2 PCR产物的回收 | 第166页 |
| 6.3.1.3 PCR产物的酶切与连接 | 第166页 |
| 6.3.1.4 重组子的鉴定 | 第166页 |
| 6.3.2 烟草遗传转化 | 第166-168页 |
| 6.3.2.1 农杆菌感受态的制备 | 第166页 |
| 6.3.2.2 农杆菌转化 | 第166-167页 |
| 6.3.2.3 烟草遗传转化 | 第167-168页 |
| 6.3.3 转基因烟草的鉴定 | 第168-169页 |
| 6.3.3.1 Basta抗性鉴定 | 第168页 |
| 6.3.3.2 PCR鉴定 | 第168页 |
| 6.3.3.3 半定量RT-PCR鉴定 | 第168页 |
| 6.3.3.4 实时荧光定量PCR鉴定 | 第168-169页 |
| 6.3.4 转基因烟草的生理指标测定 | 第169页 |
| 6.4 结果与分析 | 第169-182页 |
| 6.4.1 过表达载体的构建与转化 | 第169-173页 |
| 6.4.2 转基因烟草的鉴定 | 第173-177页 |
| 6.4.2.1 抗Basta检测 | 第173页 |
| 6.4.2.2 转基因烟草的PCR鉴定 | 第173-174页 |
| 6.4.2.3 SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因在烟草中的表达分析 | 第174-177页 |
| 6.4.3 低温胁迫下转基因烟草的表型变化 | 第177页 |
| 6.4.4 低温胁迫下转基因烟草的生理指标分析 | 第177-182页 |
| 6.4.4.1 相对电导率的变化 | 第177-178页 |
| 6.4.4.2 丙二醛含量的变化 | 第178-179页 |
| 6.4.4.3 脯氨酸含量的变化 | 第179-180页 |
| 6.4.4.4 可溶性糖含量的变化 | 第180-181页 |
| 6.4.4.5 可溶性蛋白含量的变化 | 第181-182页 |
| 6.5 讨论 | 第182-185页 |
| 6.5.1 转SgNAC1和SgNAC2基因烟草的耐寒性 | 第182-184页 |
| 6.5.2 转SgGH3基因烟草的抗寒性 | 第184-185页 |
| 6.6 本章结论 | 第185-186页 |
| 第7章 结论 | 第186-188页 |
| 7.1 全文总结 | 第186-187页 |
| 7.2 本研究的创新之处 | 第187-188页 |
| 致谢 | 第188-190页 |
| 参考 文献 | 第190-220页 |
| 附录I 标准曲线 | 第220-222页 |
| 附录II 引物表 | 第222-224页 |
| 附录III NAC基因信息 | 第224-227页 |
| 附录IV GH3基因信息 | 第227-231页 |
| 已发表论文 | 第231页 |
