| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-43页 |
| 0 前言 | 第17页 |
| 第一节 酵母中的酸性蛋白酶 | 第17-24页 |
| 1 酸性蛋白酶 | 第17-18页 |
| 2 酸性蛋白酶的应用 | 第18-19页 |
| ·在制备乳制品中的应用 | 第18-19页 |
| ·饲料添加剂 | 第19页 |
| ·酒精发酵的促进剂 | 第19页 |
| 3 酵母中的酸性蛋白酶 | 第19-22页 |
| ·酵母与酸性蛋白酶 | 第20-21页 |
| ·酸性蛋白酶与酵母的致病性 | 第21页 |
| ·海洋酵母菌与酸性蛋白酶 | 第21-22页 |
| 4 酸性蛋白酶基因的表达调控 | 第22-24页 |
| ·温度 | 第22页 |
| ·pH | 第22-23页 |
| ·培养基（碳源，氮源和外源蛋白） | 第23-24页 |
| ·培养条件 | 第24页 |
| 第二节 酵母的表达系统 | 第24-35页 |
| 1 表达系统 | 第24-25页 |
| 2 酵母菌表达系统 | 第25-28页 |
| 3 酵母表面展示系统 | 第28-35页 |
| ·表面展示技术 | 第28-29页 |
| ·酵母表面展示系统 | 第29-31页 |
| ·解脂耶罗维亚酵母表面展示系统 | 第31-35页 |
| ·酵母表面展示的应用 | 第35页 |
| 第三节 基因敲除技术及其应用 | 第35-43页 |
| 1 研究背景 | 第35页 |
| 2 利用同源重组的基因敲除 | 第35-41页 |
| ·同源重组基因敲除的步骤 | 第36-37页 |
| ·敲除片段的构建方法 | 第37-38页 |
| ·选择标记基因 | 第38页 |
| ·标记基因的删除 | 第38-41页 |
| 3 基因敲除的应用 | 第41-42页 |
| ·在代谢工程方面的应用 | 第41页 |
| ·其它应用 | 第41-42页 |
| 4 论文研究目的意义和主要内容 | 第42-43页 |
| 第二章 酸性蛋白酶基因在 Y. lipolytica 中高效表达及其在牛奶凝固中的应用 | 第43-77页 |
| 0 前言 | 第43-45页 |
| 第一节 扣囊复膜酵母 A11 菌株酸性蛋白酶基因的克隆 | 第45-53页 |
| 1 材料 | 第45-46页 |
| ·菌株和质粒 | 第45页 |
| ·试剂 | 第45-46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| 2 方法 | 第46-50页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 菌株基因组DNA 的提取 | 第46-47页 |
| ·引物设计 | 第47页 |
| ·PCR 扩增 | 第47-48页 |
| ·PCR 结果观察 | 第48页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第48页 |
| ·PCR 产物与T 载体连接 | 第48页 |
| ·大肠杆菌超级感受态的制备 | 第48-49页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第49-50页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第50页 |
| ·质粒提取 | 第50页 |
| ·阳性克隆质粒酶切验证 | 第50页 |
| ·目的片断测序和比对 | 第50页 |
| 3 结果和分析 | 第50-53页 |
| ·酸性蛋白酶基因扩增，产物回收以及转化质粒验证 | 第50-52页 |
| ·测序和序列比对、分析 | 第52-53页 |
| 第二节 扣囊复膜酵母 A11 菌株酸性蛋白酶基因的表达 | 第53-63页 |
| 1 材料 | 第53-55页 |
| ·菌株和质粒 | 第53-54页 |
| ·培养基 | 第54-55页 |
| ·试剂 | 第55页 |
| 2 方法 | 第55-59页 |
| ·总蛋白含量的测定方法 | 第55-56页 |
| ·酸性蛋白酶酶活检测方法 | 第56页 |
| ·引物设计 | 第56-57页 |
| ·PCR | 第57页 |
| ·将酸性蛋白酶基因APG 转入Y. lipolytica P01h 流程图 | 第57页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第57-58页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第58页 |
| ·质粒提取 | 第58页 |
| ·将带有酸性蛋白酶基因APG 的线性片段转入酵母Y. lipolytica P01h | 第58-59页 |
| ·产酸性蛋白酶重组菌株的筛选 | 第59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-63页 |
| ·PMD19- T -APG 重组质粒构建 | 第59-60页 |
| ·pINA1317-APG 表达质粒的构建 | 第60-61页 |
| ·pINA1317-APG 的线性化 | 第61页 |
| ·含APG 基因的质粒片段转化到Y. lipolytica P01h 和转化子的筛选 | 第61-63页 |
| 第三节 重组酸性蛋白酶的纯化、酶学性质的研究和在牛奶凝固中的应用 | 第63-76页 |
| 1 材料与方法 | 第63-68页 |
| ·菌种 | 第63页 |
| ·培养基 | 第63页 |
| ·总蛋白的测定 | 第63页 |
| ·酸性蛋白酶酶活的测定 | 第63页 |
| ·Y. lipolytica Po1h 转化子 71 的培养 | 第63页 |
| ·酸性蛋白酶粗酶液的制备 | 第63-64页 |
| ·DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析 | 第64-65页 |
| ·超滤浓缩收集液 | 第65页 |
| ·不连续SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Native 聚丙稀酰胺凝胶电泳（Native-PAGE） | 第65-66页 |
| ·蛋白酶最适反应温度和温度稳定性 | 第66-67页 |
| ·酸性蛋白酶的最适pH 和pH 稳定性 | 第67页 |
| ·金属离子对酸性蛋白酶活力的影响 | 第67页 |
| ·蛋白抑制剂对蛋白酶活性的影响 | 第67页 |
| ·酸性蛋白酶在牛奶凝聚中的应用 | 第67-68页 |
| 2 结果与分析 | 第68-76页 |
| ·酸性蛋白酶的分离纯化 | 第68-71页 |
| ·酸性蛋白酶最适反应温度和温度稳定性 | 第71-72页 |
| ·酸性蛋白酶的最适pH 和pH 稳定性 | 第72-73页 |
| ·金属离子对酸性蛋白酶活性的影响 | 第73-74页 |
| ·蛋白抑制剂对酸性蛋白酶的活性的影响 | 第74-75页 |
| ·酸性蛋白酶在牛奶凝聚中的应用 | 第75-76页 |
| 本章小结 | 第76-77页 |
| 第三章 酸性蛋白酶在 Y. lipolytica 细胞表面上展示及其在牛奶凝固中的应用 | 第77-92页 |
| 0 前言 | 第77-78页 |
| 1 材料 | 第78页 |
| ·菌株和质粒 | 第78页 |
| ·培养基和试剂 | 第78页 |
| 2 方法 | 第78-83页 |
| ·引物设计和基因扩增 | 第78-79页 |
| ·酸性蛋白酶基因APG 表面展示流程 | 第79-80页 |
| ·质粒构建图流程 | 第80页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第80-81页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第81页 |
| ·质粒提取 | 第81页 |
| ·将带有酸性蛋白酶基因APG 的线性片段转入酵母Y. lipolytica P01h | 第81页 |
| ·酸性蛋白酶表面展示菌株的筛选 | 第81页 |
| ·免疫荧光反应 | 第81-82页 |
| ·利用表面展示的酵母细胞进行牛奶凝固实验 | 第82-83页 |
| 3 结果与分析 | 第83-91页 |
| ·PMD19- T -APG 重组质粒构建 | 第83页 |
| ·pINA1317-YCWP110-APG 表达质粒的构建 | 第83-84页 |
| ·pINA1317-YlCWP110-APG 表达质粒的线性化 | 第84-85页 |
| ·含酸性蛋白酶基因APG 的质粒片段转化Y.lipolytica P01h 和转化子的筛选 | 第85-86页 |
| ·免疫荧光反应 | 第86-87页 |
| ·表面展示细胞的牛奶凝固实验 | 第87-91页 |
| 本章小结 | 第91-92页 |
| 第四章 酸性蛋白酶基因在高蛋白酵母菌 Y. lipolytica 22a-2 中高效表达及其在牛奶凝固中的应用 | 第92-109页 |
| 0 前言 | 第92-93页 |
| 第一节 高蛋白解脂耶罗维亚酵母菌22a-2 酸性蛋白酶AXP 基因克隆 | 第93-95页 |
| 1 材料 | 第93页 |
| ·菌株和质粒 | 第93页 |
| ·培养基和试剂 | 第93页 |
| 2 方法 | 第93-94页 |
| ·Y. lipolytica 22a-2 基因组DNA 的提取 | 第93页 |
| ·引物设计 | 第93页 |
| ·PCR 扩增 | 第93-94页 |
| ·PCR 产物回收 | 第94页 |
| ·测序 | 第94页 |
| 3 结果和分析 | 第94-95页 |
| ·AXP 基因的扩增 | 第94-95页 |
| ·测序和比对 | 第95页 |
| 第二节 高蛋白酵母菌 Y. lipolytica 22a-2 酸性蛋白酶 AXP 基因敲除 | 第95-105页 |
| 1 材料 | 第95-96页 |
| ·菌株和质粒 | 第95-96页 |
| ·培养基 | 第96页 |
| 2 方法 | 第96-99页 |
| ·敲除质粒的构建 | 第96-98页 |
| ·酸性蛋白酶AXP 基因的敲除 | 第98页 |
| ·敲除片段中URA3 基因的删除 | 第98-99页 |
| 3 结果和分析 | 第99-105页 |
| ·AXP 基因上游同源序列、下游同源序列以及URA3 基因的扩增 | 第99-100页 |
| ·3 个片段的连接和扩增 | 第100页 |
| ·敲除片段的测序和比对 | 第100-102页 |
| ·敲除片段转化Y. lipolytica 22a-2 和转化子的筛选 | 第102-103页 |
| ·URA3 基因的删除 | 第103-105页 |
| 第三节 扣囊复膜酵母 A11 菌株 APG 基因在酵母22a-2 敲除菌株T3-13-10 中的表达 | 第105-108页 |
| 1 材料 | 第105页 |
| 2 方法 | 第105-106页 |
| ·酸性蛋白酶活力的测定 | 第105页 |
| ·牛奶-PPB 平板上透明圈的比较 | 第105-106页 |
| ·菌体细胞干重和菌体蛋白含量的比较 | 第106页 |
| 3 结果和分析 | 第106-108页 |
| 本章小结 | 第108-109页 |
| 第五章 重组酸性蛋白酶凝固牛奶机理的初步研究 | 第109-115页 |
| 0 前言 | 第109页 |
| 1. 菌株 | 第109-110页 |
| 2 方法 | 第110页 |
| ·菌株43 重组酸性蛋白酶的纯化 | 第110页 |
| ·纯化的重组酸性蛋白酶牛奶凝聚实验 | 第110页 |
| ·纯化的重组酸性蛋白酶凝固牛奶机理的研究 | 第110页 |
| 3 结果和分析 | 第110-114页 |
| ·重组菌株43 酸性蛋白酶的纯化 | 第110-112页 |
| ·纯化的蛋白酶用于牛奶凝固实验 | 第112页 |
| ·反应产物电泳分析 | 第112-114页 |
| 本章小结 | 第114-115页 |
| 本论文总结和创新点 | 第115-117页 |
| 攻读博士期间发表论文情况 | 第117-118页 |
| 参考文献 | 第118-142页 |
| 附录：英文缩写符号中英文名称对照表 | 第142-144页 |
| 个人简介 | 第144-145页 |
| 致谢 | 第145页 |
