| 摘要 | 第5-9页 |
| ABSTRACT | 第9-13页 |
| 第1章 绪论 | 第17-29页 |
| 1.1 选题意义 | 第17-18页 |
| 1.2 研究现状 | 第18-27页 |
| 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的简介 | 第18页 |
| 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的来源 | 第18-19页 |
| 1.2.3 β-葡萄糖苷酶的生理作用 | 第19页 |
| 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的分类 | 第19-20页 |
| 1.2.5 β-葡萄糖苷酶的结构 | 第20-21页 |
| 1.2.6 β-葡萄糖苷酶的催化机制 | 第21-23页 |
| 1.2.7 β-葡萄糖苷酶的底物特异性 | 第23页 |
| 1.2.8 β-葡萄糖苷酶与启动子的研究 | 第23-24页 |
| 1.2.9 β-葡萄糖苷酶的基因工程研究进展 | 第24-25页 |
| 1.2.10 β-葡萄糖苷酶的应用 | 第25-27页 |
| 1.3 研究目的及内容 | 第27-29页 |
| 1.3.1 研究目的 | 第27-28页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第28-29页 |
| 第2章 β-葡萄糖苷酶bgl3的克隆表达 | 第29-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 菌种及载体 | 第29页 |
| 2.1.2 培养基 | 第29-30页 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-35页 |
| 2.2.1 菌丝体培养及预处理 | 第30页 |
| 2.2.2 基因组DNA提取 | 第30-31页 |
| 2.2.3 总RNA提取 | 第31页 |
| 2.2.4 mRNA的分离纯化 | 第31页 |
| 2.2.5 cDNA单链的合成 | 第31页 |
| 2.2.6 目的片段扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.7 目的片段的纯化与测序 | 第32页 |
| 2.2.8 连接pUCM-T | 第32页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态制备 | 第32页 |
| 2.2.10 转化 | 第32页 |
| 2.2.11 pET22b质粒提取 | 第32-33页 |
| 2.2.12 重组质粒pET22b-bgl3的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.13 阳性克隆筛选 | 第34页 |
| 2.2.14 双酶切验证 | 第34页 |
| 2.2.15 发酵性能测定 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第35-40页 |
| 2.3.1 基因组DNA的提取 | 第35页 |
| 2.3.2 匍枝根霉总RNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.3.3 mRNA的纯化 | 第36页 |
| 2.3.4 单链cDNA的合成 | 第36-37页 |
| 2.3.5 目的条带及测序结果 | 第37-38页 |
| 2.3.6 pET22b质粒电泳图 | 第38页 |
| 2.3.7 阳性克隆的筛选 | 第38-39页 |
| 2.3.8 酶切验证结果 | 第39页 |
| 2.3.9 发酵性能实验 | 第39-40页 |
| 2.4 小结 | 第40-41页 |
| 第3章 β-葡萄糖苷酶结构分析及定点突变 | 第41-54页 |
| 3.1 实验材料 | 第41页 |
| 3.1.1 菌种 | 第41页 |
| 3.1.2 培养基 | 第41页 |
| 3.1.3 试剂与仪器 | 第41页 |
| 3.2 实验方法 | 第41-44页 |
| 3.2.1 bgl3基因的生物信息学分析 | 第41-42页 |
| 3.2.2 关键位点确定及突变组设计 | 第42页 |
| 3.2.3 bgl3基因的修饰 | 第42-43页 |
| 3.2.4 突变株的构建 | 第43页 |
| 3.2.5 重组载体的诱导表达 | 第43-44页 |
| 3.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-52页 |
| 3.3.1 BGLⅢ基本特性分析 | 第44-45页 |
| 3.3.2 BGLⅢ序列的同源比对 | 第45-46页 |
| 3.3.3 BGLⅢ序列的同源建模及分子对接 | 第46-47页 |
| 3.3.4 关键位点的确定 | 第47页 |
| 3.3.5 Trp127突变前后静电势的改变 | 第47页 |
| 3.3.6 Trp127突变前后疏水性的变化 | 第47-48页 |
| 3.3.7 BGLⅢ分子动力学分析 | 第48-49页 |
| 3.3.8 bgl3的定点突变 | 第49-50页 |
| 3.3.9 突变株的构建 | 第50-51页 |
| 3.3.10 突变株发酵实验 | 第51-52页 |
| 3.3.11 SDS-PAGE | 第52页 |
| 3.4 小结 | 第52-54页 |
| 第4章 重组菌的纯化与酶学性质研究 | 第54-62页 |
| 4.1 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.1.1 菌种 | 第54页 |
| 4.1.2 培养基 | 第54页 |
| 4.1.3 试剂与仪器 | 第54-55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55-57页 |
| 4.2.1 蛋白质含量的测定 | 第55页 |
| 4.2.2 发酵罐放大实验 | 第55页 |
| 4.2.3 发酵粗酶液的制备 | 第55页 |
| 4.2.4 BGⅢ蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| 4.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第56页 |
| 4.2.6 酶学特性分析 | 第56-57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-61页 |
| 4.3.1 蛋白质标准曲线的绘制 | 第57页 |
| 4.3.2 重组菌的发酵、收集菌体和粗酶液制备 | 第57页 |
| 4.3.3 BGLⅢ的分离纯化 | 第57-58页 |
| 4.3.4 β-葡萄糖苷酶的酶学性质分析 | 第58-61页 |
| 4.4 小结 | 第61-62页 |
| 第5章 构建强启动子匍枝根霉转化菌株 | 第62-70页 |
| 5.1 实验材料 | 第62页 |
| 5.1.1 菌种 | 第62页 |
| 5.1.2 培养基 | 第62页 |
| 5.1.3 主要试剂及仪器 | 第62页 |
| 5.2 实验方法 | 第62-65页 |
| 5.2.1 P_(GlaA)启动子的克隆 | 第62-63页 |
| 5.2.2 融合基因glaA-bgl3的构建及克隆 | 第63-64页 |
| 5.2.3 融合基因转化匍枝根霉分生孢子 | 第64-65页 |
| 5.2.4 匍枝根霉转化子纤维素酶活力的测定 | 第65页 |
| 5.3 实验结果 | 第65-69页 |
| 5.3.1 黑曲霉P_(GlaA)的克隆 | 第65-66页 |
| 5.3.2 融合基因glaA-bgl3的构建 | 第66-67页 |
| 5.3.3 融合基因glaA-bgl3构建同源臂 | 第67-68页 |
| 5.3.4 匍枝根霉分生孢子转化子筛选 | 第68页 |
| 5.3.5 匍枝根霉转化子PCR验证 | 第68页 |
| 5.3.6 匍枝根霉转化子摇瓶发酵实验 | 第68-69页 |
| 5.4 小结 | 第69-70页 |
| 第6章 结论与展望 | 第70-73页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 展望 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-84页 |
| 攻读硕士期间发表论文 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |