| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 研究背景 | 第11-12页 |
| 1.2 稻瘟病研究进展 | 第12-14页 |
| 1.2.1 稻瘟病抗性基因的遗传学研究 | 第12页 |
| 1.2.2 稻瘟病抗性基因的定位和克隆研究 | 第12-14页 |
| 1.3 相关候选基因研究进展 | 第14-16页 |
| 1.3.1 α-酮戊二酸/苹果酸载体蛋白研究 | 第14页 |
| 1.3.2 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶研究 | 第14-15页 |
| 1.3.3 DNA复制蛋白A的研究 | 第15-16页 |
| 1.4 实时荧光定量PCR | 第16页 |
| 1.5 RACE技术 | 第16-17页 |
| 1.6 农杆菌介导的遗传转化 | 第17页 |
| 1.7 研究目的及意义 | 第17-19页 |
| 第二章 候选基因表达量分析 | 第19-27页 |
| 2.1 实验材料 | 第19页 |
| 2.1.1 植物材料和菌株 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-23页 |
| 2.2.1 材料准备 | 第19-20页 |
| 2.2.1.1 水稻幼苗的种植 | 第19页 |
| 2.2.1.2 稻瘟病菌的活化、培养及孢子悬浮液的配制 | 第19-20页 |
| 2.2.1.3 水稻幼苗接种和叶片采集 | 第20页 |
| 2.2.2 目的基因mRNA序列的获得 | 第20页 |
| 2.2.3 水稻叶片总RNA的提取 | 第20-21页 |
| 2.2.4 cDNA的合成 | 第21-22页 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR引物设计 | 第22页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR反应 | 第22-23页 |
| 2.3 结果与分析 | 第23-26页 |
| 2.3.1 水稻幼苗接种稻瘟病菌“四川-43” | 第23-24页 |
| 2.3.2 水稻总RNA的鉴定 | 第24页 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR分析 | 第24-26页 |
| 2.4 讨论 | 第26-27页 |
| 第三章 候选基因的克隆及序列分析 | 第27-43页 |
| 3.1 实验材料 | 第27页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第27页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第27页 |
| 3.2 实验方法 | 第27-36页 |
| 3.2.1 候选基因编码区序列扩增 | 第27-30页 |
| 3.2.1.1 提取叶片总RNA | 第27页 |
| 3.2.1.2 cDNA的获得 | 第27页 |
| 3.2.1.3 引物设计 | 第27-28页 |
| 3.2.1.4 目的片段扩增及回收 | 第28-29页 |
| 3.2.1.5 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接 | 第29页 |
| 3.2.1.6 连接产物转化Transl-T1感受态细胞 | 第29-30页 |
| 3.2.1.7 测序及序列分析 | 第30页 |
| 3.2.2 候选基因非编码区序列的扩增 | 第30-33页 |
| 3.2.2.1 提取云引和丽江新团黑谷叶片总RNA | 第30页 |
| 3.2.2.2 cDNA的合成 | 第30-31页 |
| 3.2.2.3 候选基因RACE引物设计 | 第31页 |
| 3.2.2.4 目的基因5'UTR及3'UTR的扩增及回收 | 第31-32页 |
| 3.2.2.5 目的片段与pEASYTM-Blunt Cloning Vector连接及转化 | 第32页 |
| 3.2.2.6 测序及序列分析 | 第32-33页 |
| 3.2.3 候选基因启动子序列的扩增 | 第33-35页 |
| 3.2.3.1 叶片总DNA的提取 | 第33页 |
| 3.2.3.2 启动子序列引物设计 | 第33-34页 |
| 3.2.3.3 启动子序列扩增及回收 | 第34页 |
| 3.2.3.4 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接 | 第34页 |
| 3.2.3.5 测序及序列分析 | 第34-35页 |
| 3.2.4 云引和丽江新团黑谷OsOGCP和OsDXR基因组序列的扩增 | 第35-36页 |
| 3.2.4.1 基因组序列引物设计 | 第35页 |
| 3.2.4.2 基因组序列扩增 | 第35页 |
| 3.2.4.3 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接 | 第35页 |
| 3.2.4.4 测序及序列分析 | 第35-36页 |
| 3.3 结果与分析 | 第36-41页 |
| 3.3.1 云引和丽江新团黑谷中目的基因编码区序列克隆和比对 | 第36-37页 |
| 3.3.2 云引中候选基因5'和3'非编码区序列扩增 | 第37-38页 |
| 3.3.3 云引和丽江新团黑谷中候选基因启动子克隆及序列比对 | 第38-40页 |
| 3.3.4 候选基因OsOGCP和OsDXR基因组结构分析 | 第40-41页 |
| 3.3.5 目的基因的进化树构建及分析 | 第41页 |
| 3.4 讨论 | 第41-43页 |
| 第四章 候选基因植物过量表达载体、亚细胞定位载体和干扰载体的构建及遗传转化 | 第43-60页 |
| 4.1 实验材料 | 第43页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第43页 |
| 4.1.2 植物材料 | 第43页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第43页 |
| 4.2 实验方法 | 第43-52页 |
| 4.2.1 候选基因过量表达载体和亚细胞定位载体的构建 | 第43-48页 |
| 4.2.1.1 目的基因酶切位点分析 | 第43页 |
| 4.2.1.2 带酶切位点的目的基因的扩增 | 第43-45页 |
| 4.2.1.3 目的片段与pEASy~(TM)-Blunt Cloning Vector连接及转化 | 第45页 |
| 4.2.1.4 目的片段测序及序列分析 | 第45页 |
| 4.2.1.5 双酶切含目的基因的阳性质粒及pCAMBIA1302空载体 | 第45-47页 |
| 4.2.1.6 目的片段与pCAMBIA1302载体的连接 | 第47页 |
| 4.2.1.7 连接产物转化与鉴定 | 第47页 |
| 4.2.1.8 过表达载体冻融法转化农杆菌 | 第47-48页 |
| 4.2.2 候选基因RNAi干扰表达载体的构建 | 第48-52页 |
| 4.2.2.1 带酶切位点的目的基因的扩增及回收 | 第48-50页 |
| 4.2.2.2 目的片段与pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector连接及转化 | 第50页 |
| 4.2.2.3 目的片段测序及序列分析 | 第50页 |
| 4.2.2.4 RNAi干扰中间载体构建 | 第50-51页 |
| 4.2.2.5 候选基因RNAi干扰表达载体第二联构建 | 第51-52页 |
| 4.2.2.6 RNAi干扰表达载体冻融法转化农杆菌GV3101 | 第52页 |
| 4.3 农杆菌介导水稻遗传转化 | 第52-53页 |
| 4.4 结果与分析 | 第53-59页 |
| 4.4.1 植物过量表达载体和亚细胞定位载体的获得 | 第53-56页 |
| 4.4.2 植物干扰表达载体的获得 | 第56-58页 |
| 4.4.3 农杆菌介导的遗传转化 | 第58-59页 |
| 4.5 讨论 | 第59-60页 |
| 第五章 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-69页 |
| 附录 | 第69-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
