| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 引言 | 第14-26页 |
| 1 研究的目的和意义 | 第14-16页 |
| 2 Ⅱ型鲤疱疹病毒 | 第16-22页 |
| 2.1 Ⅱ型鲤疱疹病毒所造成的危害 | 第16-17页 |
| 2.2 Ⅱ型鲤疱疹病毒检测技术的研究现状 | 第17-22页 |
| 2.2.1 CyHV-2 细胞培养分离技术 | 第17-18页 |
| 2.2.2 电镜诊断技术 | 第18-19页 |
| 2.2.3 分子诊断技术 | 第19-20页 |
| 2.2.3.1 PCR | 第19页 |
| 2.2.3.2 实时荧光定量PCR | 第19页 |
| 2.2.3.3 环介导等温扩增 | 第19-20页 |
| 2.2.3.4 原位杂交技术 | 第20页 |
| 2.2.4 免疫相关研究进展 | 第20-22页 |
| 3 病毒纯化 | 第22页 |
| 4 单克隆抗体技术 | 第22-24页 |
| 5 Ⅱ型鲤疱疹病毒免疫学诊断方法的前景展望 | 第24页 |
| 6 本文的设计思路 | 第24-26页 |
| 第一章 Ⅱ型鲤疱疹病毒的纯化及电镜观察 | 第26-34页 |
| 1 材料与方法 | 第26-29页 |
| 1.1 试验材料与试剂 | 第26页 |
| 1.1.1 试验材料 | 第26页 |
| 1.1.2 试验试剂及溶液配制 | 第26页 |
| 1.2 试验所用仪器与设备 | 第26-27页 |
| 1.3 试验方法 | 第27-29页 |
| 1.3.1 CYHV-2 病毒的扩增 | 第27-28页 |
| 1.3.1.1 组织总DNA的提取 | 第27-28页 |
| 1.3.1.2 聚合酶链式反应 | 第28页 |
| 1.3.1.3 病毒回感 | 第28页 |
| 1.3.2 蔗糖密度梯度超速离心法纯化CyHV-2 病毒 | 第28-29页 |
| 1.3.3 纯化后病毒的电镜观察 | 第29页 |
| 2 试验结果与分析 | 第29-32页 |
| 2.1 异育银鲫感染CyHV-2 病毒 | 第29-30页 |
| 2.2 密度梯度离心纯化产物 | 第30-31页 |
| 2.3 病毒纯化后的电镜观察 | 第31-32页 |
| 3 讨论 | 第32-34页 |
| 第二章 Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备及初步检测分析 | 第34-45页 |
| 1 材料与方法 | 第34-39页 |
| 1.1 试验材料和试验试剂 | 第34页 |
| 1.2 所用仪器与设备 | 第34-35页 |
| 1.3 所使用的软件 | 第35页 |
| 1.4 试验方法 | 第35-39页 |
| 1.4.1 采用PCR的方法获得病毒ORF72的基因序列 | 第35-36页 |
| 1.4.1.1 提取Ⅱ型鲤疱疹病毒总的DNA | 第35页 |
| 1.4.1.2 ORF72基因扩增 | 第35页 |
| 1.4.1.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第35页 |
| 1.4.1.4 用DNA回收试剂盒回收扩增后的DNA片段 | 第35-36页 |
| 1.4.2 重组质粒载体的构建与原核表达 | 第36-37页 |
| 1.4.2.1 重组质粒载体的构建 | 第36页 |
| 1.4.2.2 连接产物的转化 | 第36-37页 |
| 1.4.2.3 阳性克隆的筛选 | 第37页 |
| 1.4.2.4 诱导表达和可溶性分析 | 第37页 |
| 1.4.2.5 诱导表达条件的优化 | 第37页 |
| 1.4.3 目的蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| 1.4.4 多克隆抗体的制备 | 第38页 |
| 1.4.5 血清抗体特异性分析 | 第38页 |
| 1.4.6 基于ORF72的病毒诱导抗体的免疫学检测 | 第38-39页 |
| 2．试验结果和分析 | 第39-43页 |
| 2.1 ORF72基因扩增 | 第39-40页 |
| 2.2 重组蛋白rORF72的诱导表达及可溶性分析 | 第40页 |
| 2.3 重组蛋白rORF72表达条件的优化 | 第40-41页 |
| 2.4 目的蛋白rORF72的纯化 | 第41-42页 |
| 2.5 多克隆抗体的制备及特异性分析 | 第42页 |
| 2.6 基于rORF72的病毒诱导抗体的免疫学检测 | 第42-43页 |
| 3．讨论 | 第43-45页 |
| 第三章 Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72单克隆抗体的制备及其在异育银鲫出血病检测中的应用 | 第45-56页 |
| 1 材料与方法 | 第45-50页 |
| 1.1 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞以及试验用小鼠 | 第45页 |
| 1.2 设备及仪器 | 第45页 |
| 1.3 实验用药品与溶液配制 | 第45-46页 |
| 1.4 抗Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72单克隆抗体的制备 | 第46-48页 |
| 1.4.1 细胞融合及培养 | 第46-47页 |
| 1.4.2 对能够稳定分泌抗体的细胞株进行亚克隆 | 第47页 |
| 1.4.3 用Dot Blot法对细胞上清液进行阳性克隆的筛选 | 第47页 |
| 1.4.4 对筛选的细胞株进行Western Blot验证 | 第47-48页 |
| 1.5 腹水制备及纯化 | 第48页 |
| 1.6 3D8株抗体亚型的测定 | 第48页 |
| 1.7 单克隆抗体在检测CyHV-2 中的应用 | 第48-50页 |
| 1.7.1 试验样品的获得 | 第48页 |
| 1.7.2 检测方法 | 第48-50页 |
| 2．结果与分析 | 第50-54页 |
| 2.1 rORF72单克隆抗体的制备及筛选 | 第50页 |
| 2.2.rORF72单克隆抗体 3D8株细胞的亚克隆及腹水的制备 | 第50-51页 |
| 2.3 rORF72单克隆抗体 3D8株细胞亚型的检测 | 第51页 |
| 2.4 IFA检测 | 第51-53页 |
| 2.5 血涂片检测 | 第53-54页 |
| 3.讨论 | 第54-56页 |
| 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-65页 |
| 附录：论文发表情况 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
