| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-34页 |
| 1.1 谷胱甘肽及其新型双功能合成酶的应用研究现状 | 第18-24页 |
| 1.1.1 谷胱甘肽的性质 | 第18页 |
| 1.1.2 谷胱甘肽的功能及应用领域 | 第18-20页 |
| 1.1.3 谷胱甘肽的生产方法 | 第20-23页 |
| 1.1.4 谷胱甘肽新型双功能合成酶 | 第23-24页 |
| 1.2 ATP再生体系及相关酶的研究 | 第24-27页 |
| 1.2.1 ATP再生 | 第24页 |
| 1.2.2 ATP再生在生物催化中的应用意义 | 第24-25页 |
| 1.2.3 几种不同的ATP再生途径 | 第25-27页 |
| 1.2.4 体外ATP再生体系及用于ATP再生的新兴酶 | 第27页 |
| 1.3 微生物酶的分离纯化 | 第27-30页 |
| 1.3.1 预分离 | 第27-28页 |
| 1.3.2 沉淀法 | 第28-29页 |
| 1.3.3 膜分离技术 | 第29-30页 |
| 1.3.4 层析法 | 第30页 |
| 1.4 酶的定向进化 | 第30-32页 |
| 1.4.1 定向进化简述 | 第30页 |
| 1.4.2 定向进化的分类 | 第30-31页 |
| 1.4.3 酶的定向进化的应用 | 第31页 |
| 1.4.4 易错PCR技术 | 第31-32页 |
| 1.5 本课题的研究目的及意义 | 第32-34页 |
| 1.5.1 本课题已有研究基础 | 第32页 |
| 1.5.2 本课题研究目的及意义 | 第32-34页 |
| 第二章 谷胱甘肽合成酶GshF和PPK酶表达优化方法研究 | 第34-58页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 实验材料 | 第34-35页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和引物 | 第34-35页 |
| 2.2.2 试剂和仪器 | 第35页 |
| 2.3 实验方法 | 第35-41页 |
| 2.3.1 谷胱甘肽合成酶GshF和ATP再生体系酶PPK的菌种复苏培养 | 第35-36页 |
| 2.3.2 粗酶液制备 | 第36页 |
| 2.3.3 蛋白含量及酶活测定反应的标准曲线制作 | 第36-37页 |
| 2.3.4 双酶联产产物含量测定 | 第37页 |
| 2.3.5 GshF和PPK两种目的酶的重组质粒转入OrigamB和Roestta表达菌 | 第37页 |
| 2.3.6 不同表达菌种的目的酶表达量对比 | 第37-38页 |
| 2.3.7 采用Quantity one软件分析粗酶液中目的蛋白的相对质量百分比 | 第38页 |
| 2.3.8 蛋白酶表达的包涵体验证 | 第38页 |
| 2.3.9 构建目的酶PPK重组质粒 | 第38-39页 |
| 2.3.10 重组质粒与分子伴侣共转化 | 第39-40页 |
| 2.3.11 重组质粒与分子伴侣共表达及表达量验证 | 第40-41页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第41-57页 |
| 2.4.1 保藏菌种复苏培养酶蛋白表达电泳验证 | 第41页 |
| 2.4.2 考马斯亮蓝法测蛋白含量 | 第41-42页 |
| 2.4.3 四氧嘧啶测谷胱甘肽标准曲线 | 第42-43页 |
| 2.4.4 不同目的酶混合方式参与体外合成GSH的产量验证 | 第43-44页 |
| 2.4.5 重组质粒(pETDUET-gshf-ppk)在Rosetta和BL21(DE3)中表达的蛋白电泳结果 | 第44页 |
| 2.4.6 Rosetta和BL21表达酶蛋白电泳图的Quantity One定量分析对比 | 第44-45页 |
| 2.4.7 大肠杆菌三种表达菌BL21、OrigamB、Rosetta的表达效果同步对照 | 第45-46页 |
| 2.4.8 蛋白酶表达的包涵体验证 | 第46页 |
| 2.4.9 目的酶PPK重组质粒构建及效果 | 第46-49页 |
| 2.4.10 诱导时间不同对包涵体形成的影响 | 第49页 |
| 2.4.11 分子伴侣共表达提高目的酶表达量 | 第49-57页 |
| 2.5 小结 | 第57-58页 |
| 第三章 GshF酶和PPK酶粗酶液的分离纯化方法研究 | 第58-82页 |
| 3.1 引言 | 第58页 |
| 3.2 实验材料 | 第58页 |
| 3.2.1 菌株、质粒和引物 | 第58页 |
| 3.2.2 试剂和仪器 | 第58页 |
| 3.3 实验方法 | 第58-62页 |
| 3.3.1 谷胱甘肽合成酶GshF和多聚磷酸激酶PPK的诱导表达及粗酶液制备 | 第58-59页 |
| 3.3.2 GshF和PPK的酶活测定方法 | 第59-60页 |
| 3.3.3 粗酶液在不同硫酸铵饱和度的盐析沉淀效果 | 第60页 |
| 3.3.4 硫酸铵盐析法分离纯化目的酶GshF和PPK | 第60-61页 |
| 3.3.5 超滤法分离纯化目的酶GshF和PPK | 第61页 |
| 3.3.6 冷丙酮沉淀法纯化目的酶 | 第61页 |
| 3.3.7 联合法分离纯化酶蛋白 | 第61-62页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第62-80页 |
| 3.4.1 目的酶GshF和PPK的硫酸铵盐析条件范围测定 | 第62-66页 |
| 3.4.2 目的酶硫酸铵盐析纯化优化结果 | 第66-71页 |
| 3.4.3 超滤纯化效果 | 第71-73页 |
| 3.4.4 盐析超滤联合纯化效果 | 第73-77页 |
| 3.4.5 冷丙酮沉淀法分离纯化目的酶蛋白 | 第77-80页 |
| 3.5 小结 | 第80-82页 |
| 第四章 PPK酶的结构模拟分析及定向进化改造研究 | 第82-106页 |
| 4.1 引言 | 第82页 |
| 4.2 实验试剂及材料 | 第82-83页 |
| 4.2.1 菌株、质粒和引物 | 第82页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第82-83页 |
| 4.3 实验方法 | 第83-86页 |
| 4.3.1 PPK1酶及PPK2酶的亲疏水基结构模拟分析 | 第83页 |
| 4.3.2 PPK1酶的底物分子对接分析 | 第83页 |
| 4.3.3 易错PCR克隆目的酶序列 | 第83-84页 |
| 4.3.4 突变序列重组质粒的构建 | 第84页 |
| 4.3.5 将重组质粒转化到E.coli并验证 | 第84-85页 |
| 4.3.6 重组质粒突变率分析 | 第85页 |
| 4.3.7 ATP产量测定反应条件优化及标准曲线制作 | 第85页 |
| 4.3.8 突变株产酶效率验证及结构分析 | 第85-86页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第86-104页 |
| 4.4.1 亲疏水基结构模拟对比分析 | 第86-88页 |
| 4.4.2 底物结合口袋与分子对接模拟分析 | 第88-90页 |
| 4.4.3 易错PCR中Mn~(2+)浓度的优化 | 第90-91页 |
| 4.4.4 重组质粒的构建及转化 | 第91页 |
| 4.4.5 转化后突变质粒的测序及突变率分析 | 第91-98页 |
| 4.4.6 ATP产量测定反应条件优化结果及标准曲线 | 第98-102页 |
| 4.4.7 突变株产酶效率验证及结构分析 | 第102-104页 |
| 4.5 小结 | 第104-106页 |
| 第五章 结论与创新点 | 第106-108页 |
| 5.1 本文主要结论 | 第106-107页 |
| 5.2 研究创新点 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-114页 |
| 附录 | 第114-118页 |
| 致谢 | 第118-120页 |
| 作者及导师简介 | 第120-121页 |
| 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书 | 第121-122页 |
