| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 引言 | 第16-18页 |
| 上篇 文献综述 | 第18-69页 |
| 第一章 疫霉菌发育过程相关信号通路的研究进展 | 第19-41页 |
| 1 疫霉菌发育阶段的调控基因 | 第19-23页 |
| 1.1 孢子囊的形成与游动孢子的释放 | 第19-20页 |
| 1.2 游动孢子的游动与休止 | 第20-21页 |
| 1.3 休止孢的萌发 | 第21-22页 |
| 1.4 卵孢子的形成 | 第22-23页 |
| 2 调控疫霉菌发育的信号通路与信号因子 | 第23-34页 |
| 2.1 感知:GPCR/G蛋白信号通路 | 第23-26页 |
| 2.2 传递:蛋白激酶 | 第26-29页 |
| 2.3 调控:转录因子 | 第29-34页 |
| 参考文献 | 第34-41页 |
| 第二章 趋化物感应:趋化性 | 第41-69页 |
| 1 趋化性概述 | 第41-42页 |
| 2 原核生物的趋化性 | 第42-48页 |
| 2.1 趋化性的作用 | 第42-43页 |
| 2.2 趋化感应系统 | 第43-45页 |
| 2.3 趋化受体 | 第45-47页 |
| 2.4 其它趋化蛋白 | 第47-48页 |
| 3 真核模式生物的趋化性 | 第48-54页 |
| 3.1 概述 | 第48-49页 |
| 3.2 趋化物浓度梯度的产生 | 第49-50页 |
| 3.3 GPCR/G蛋白信号通路参与调控趋化性过程 | 第50-51页 |
| 3.4 GPCR/G蛋白信号通路的趋化反应模型 | 第51-52页 |
| 3.5 GPCR调控的信号通路作用于肌动蛋白网络 | 第52-54页 |
| 4 植物病原卵菌的趋化性 | 第54-59页 |
| 4.1 游动孢子及萌发后芽管的趋化反应 | 第54-55页 |
| 4.2 部分趋化现象具有寄主特异性 | 第55页 |
| 4.3 丝囊霉类黄酮受体的检测 | 第55-56页 |
| 4.4 G蛋白与GPCR-PIPK对趋化性的调控 | 第56-59页 |
| 参考文献 | 第59-69页 |
| 下篇 研究内容 | 第69-171页 |
| 第一章 PsGPA1互作蛋白的筛选与鉴定 | 第71-89页 |
| 1 材料与方法 | 第73-79页 |
| 1.1 供试菌株 | 第73-74页 |
| 1.2 培养基及试剂配制 | 第74页 |
| 1.3 大豆疫霉菌株的培养及孢子囊阶段菌体的获得 | 第74-75页 |
| 1.4 载体构建 | 第75-76页 |
| 1.5 大豆疫霉总蛋白的提取 | 第76-77页 |
| 1.6 Western blot鉴定目标蛋白 | 第77页 |
| 1.7 亲和纯化试验流程 | 第77-78页 |
| 1.8 质谱分析 | 第78页 |
| 1.9 候选蛋白功能域分析 | 第78页 |
| 1.10 重组蛋白的原核表达 | 第78-79页 |
| 1.11 GST pull-down试验流程 | 第79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-85页 |
| 2.1 融合了3×FLAG标签的PsGPA1表达菌株的获得 | 第79-80页 |
| 2.2 亲和纯化筛选PsGPA1互作蛋白 | 第80-81页 |
| 2.3 洗脱蛋白质谱鉴定结果分析 | 第81-82页 |
| 2.4 候选蛋白功能域分析 | 第82-83页 |
| 2.5 GST pull-down验证候选蛋白与PsGPA1的互作关系 | 第83-85页 |
| 3 讨论 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-89页 |
| 第二章 PsPGA1的互作蛋白PsHint1参与调控大豆疫霉的趋化性及致病性 | 第89-125页 |
| 1 材料与方法 | 第91-97页 |
| 1.1 供试菌株 | 第91-92页 |
| 1.2 互作验证 | 第92页 |
| 1.3 生物信息学分析 | 第92页 |
| 1.4 大豆疫霉DNA、RNA提取及cDNA的制备 | 第92-93页 |
| 1.5 载体构建 | 第93-95页 |
| 1.6 大豆疫霉原生质体转化 | 第95页 |
| 1.7 SYBR Green实时定量PCR验证 | 第95页 |
| 1.8 PsHint1沉默转化子各发育阶段表型观测 | 第95-97页 |
| 1.9 PsHint1沉默转化子致病性分析 | 第97页 |
| 2 结果与分析 | 第97-117页 |
| 2.1 PsHint1与PsGPA1互作验证 | 第97-101页 |
| 2.2 PsHint1蛋白多重序列比对和系统发育分析 | 第101-105页 |
| 2.3 PsHint1在侵染阶段上调表达 | 第105页 |
| 2.4 PsHint1在大豆疫霉中的亚细胞定位 | 第105-106页 |
| 2.5 PsHint1沉默转化子的获得 | 第106-108页 |
| 2.6 PsHint1的基因沉默影响了游动孢子趋化性 | 第108-111页 |
| 2.7 PsHint1的沉默导致休止孢萌发异常 | 第111-113页 |
| 2.8 PsHint1参与调控大豆疫霉致病过程 | 第113-117页 |
| 3 讨论 | 第117-121页 |
| 参考文献 | 第121-125页 |
| 第三章 致病相关蛋白PsHint1参与调控的下游信号通路分析 | 第125-155页 |
| 1 材料与方法 | 第128-132页 |
| 1.1 供试菌株 | 第128页 |
| 1.2 培养基配制 | 第128页 |
| 1.3 融合FLAG标签的PsHint1表达载体的构建 | 第128-129页 |
| 1.4 大豆疫霉菌株的培养及无性发育各阶段菌体的获得 | 第129页 |
| 1.5 大豆疫霉对氧化压力胁迫环境的耐受性测定 | 第129-130页 |
| 1.6 大豆黄化苗下胚轴表皮细胞活性氧积累的细胞学观察 | 第130页 |
| 1.7 DPI处理抑制寄主活性氧积累实验 | 第130页 |
| 1.8 大豆疫霉不同侵染时间点的RNA提取及cDNA的制备 | 第130-131页 |
| 1.9 SYBR Green实时定量PCR分析 | 第131-132页 |
| 1.10 数据相关性分析 | 第132页 |
| 1.11 亲和纯化筛选互作蛋白 | 第132页 |
| 2 结果与分析 | 第132-146页 |
| 2.1 PsHint1沉默突变体侵染点周围活性氧大量积累 | 第132-133页 |
| 2.2 PsHint1的沉默影响大豆疫霉对H_2O_2的耐受性 | 第133-134页 |
| 2.3 对ROS的抑制可以部分恢复PsHint1沉默转化子的致病力 | 第134-137页 |
| 2.4 PsHint1的沉默影响了RxLR效应分子的正常转录模式 | 第137-139页 |
| 2.5 PsHint1沉默转化子侵染阶段RNA-Seq结果分析 | 第139-143页 |
| 2.6 亲和纯化筛选PsHint1互作蛋白 | 第143-145页 |
| 2.7 洗脱蛋白质谱鉴定 | 第145-146页 |
| 3 讨论 | 第146-150页 |
| 参考文献 | 第150-155页 |
| 第四章 PsGPA1靶标蛋白的筛选及功能分析 | 第155-171页 |
| 1 材料与方法 | 第157-160页 |
| 1.1 供试菌株 | 第157页 |
| 1.2 培养基及试剂配制 | 第157页 |
| 1.3 大豆疫霉菌株的培养及孢子囊阶段菌体的获得 | 第157-158页 |
| 1.4 载体构建 | 第158页 |
| 1.5 大豆疫霉总蛋白的提取 | 第158-159页 |
| 1.6 亲和纯化试验流程 | 第159页 |
| 1.7 质谱分析 | 第159页 |
| 1.8 候选蛋白功能域分析 | 第159-160页 |
| 1.9 重组蛋白的原核表达 | 第160页 |
| 1.10 GST pull-down试验流程 | 第160页 |
| 1.11 SYBR Green实时定量PCR验证 | 第160页 |
| 2 结果与分析 | 第160-167页 |
| 2.1 亲和纯化筛选PsGPA1靶标蛋白 | 第160-161页 |
| 2.2 洗脱蛋白质谱鉴定结果分析 | 第161-162页 |
| 2.3 候选蛋白功能域分析 | 第162-163页 |
| 2.4 候选基因均在侵染阶段上调表达 | 第163-164页 |
| 2.5 部分候选蛋白在孢子囊或侵染阶段被磷酸化 | 第164-165页 |
| 2.6 GST pull-down验证候选蛋白与PsGPA1的互作关系 | 第165-167页 |
| 3 讨论 | 第167-169页 |
| 参考文献 | 第169-171页 |
| 附录一 疫霉菌蛋白共表达体系的建立 | 第171-185页 |
| 1 材料与方法 | 第173-176页 |
| 1.1 Golden Gate操作步骤 | 第173-174页 |
| 1.2 In Fusion操作步骤 | 第174页 |
| 1.3 co-IP载体的构建 | 第174-175页 |
| 1.4 供试菌株 | 第175-176页 |
| 1.5 大豆疫霉原生质体转化 | 第176页 |
| 2 结果与分析 | 第176-182页 |
| 2.1 基于pTOR-mRFP的共表达载体改造 | 第176-178页 |
| 2.2 用于Golden Gate的一级载体改造 | 第178-179页 |
| 2.3 用于Golden Gate的元件设计 | 第179-181页 |
| 2.4 疫霉蛋白共表达体系的应用 | 第181-182页 |
| 3 讨论 | 第182-183页 |
| 参考文献 | 第183-185页 |
| 附录二 CRISPR-Cas9技术在疫霉菌中的应用探索 | 第185-201页 |
| 1 材料与方法 | 第187-190页 |
| 1.1 载体的构建 | 第187-189页 |
| 1.2 Golden Gate操作步骤 | 第189页 |
| 1.3 供试菌株 | 第189页 |
| 1.4 大豆疫霉原生质体转化 | 第189页 |
| 1.5 大豆疫霉菌丝细胞核的染色 | 第189-190页 |
| 1.6 转化子的验证 | 第190页 |
| 2 结果与分析 | 第190-195页 |
| 2.1 目标基因及靶标序列确定 | 第190-191页 |
| 2.2 核定位信号预测及试验验证 | 第191-192页 |
| 2.3 Cas9及sgRNA共表达载体的构建 | 第192-193页 |
| 2.4 转化子筛选 | 第193-194页 |
| 2.5 Nmcas9的使用 | 第194-195页 |
| 3 讨论 | 第195-197页 |
| 参考文献 | 第197-201页 |
| 全文总结及创新点 | 第201-203页 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 | 第203-205页 |
| 致谢 | 第205页 |
