| 摘要 | 第9-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| 1.1 引言 | 第14-15页 |
| 1.2 土壤铜污染的来源 | 第15页 |
| 1.3 铜的生理功能及毒性 | 第15-16页 |
| 1.3.1 铜的生理功能 | 第15页 |
| 1.3.2 铜的生理毒性 | 第15-16页 |
| 1.4 铜对根瘤菌-豆科植物共生结瘤的影响 | 第16-17页 |
| 1.5 微生物的抗铜分子机制 | 第17-25页 |
| 1.5.1 铜转运P-type ATPase | 第18-20页 |
| 1.5.2 Cus外排系统 | 第20-21页 |
| 1.5.3 多铜氧化酶CueO | 第21-23页 |
| 1.5.4 质粒编码的Pco/Cop系统 | 第23页 |
| 1.5.5 其它抗铜机制 | 第23-25页 |
| 1.5.6 根瘤菌抗铜分子机制研究进展 | 第25页 |
| 1.6 抗铜系统的调节 | 第25-27页 |
| 1.6.1 单组份调节子 | 第25-26页 |
| 1.6.2 双组份调节系统 | 第26-27页 |
| 1.6.3 其它调节机制 | 第27页 |
| 1.7 慢生根瘤菌相关进展 | 第27-29页 |
| 1.8 本研究的目的意义及技术路线 | 第29-31页 |
| 1.8.1 目的意义 | 第29-30页 |
| 1.8.2 技术路线 | 第30-31页 |
| 第二章 转座子随机突变及铜抗性基因的克隆 | 第31-50页 |
| 2.1 前言 | 第31页 |
| 2.2 材料、试剂和仪器 | 第31-33页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第31页 |
| 2.2.2 实验试剂 | 第31-32页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第32-33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-37页 |
| 2.3.1 抗生素筛选 | 第33页 |
| 2.3.2 确定筛选铜浓度 | 第33页 |
| 2.3.3 突变体库建立、铜敏感突变体筛选及正确性检验 | 第33-35页 |
| 2.3.4 鉴定转座子插入位点 | 第35-36页 |
| 2.3.5 突变体的重金属抗性分析 | 第36-37页 |
| 2.3.6 基因全长及上下游基因扩增 | 第37页 |
| 2.4 结果与分析 | 第37-45页 |
| 2.4.1 双抗生素筛选策略 | 第37-38页 |
| 2.4.2 突变体库的建立及铜敏感突变体筛选 | 第38-40页 |
| 2.4.3 铜敏感突变株生长的测定 | 第40-41页 |
| 2.4.4 突变株对铜及其它重金属耐受性 | 第41页 |
| 2.4.5 铜敏感突变体基因组DNA酶切、自连和转化 | 第41-42页 |
| 2.4.6 Tn5插入基因的序列分析与功能预测 | 第42-44页 |
| 2.4.7 突变基因上下游基因及物理图谱 | 第44-45页 |
| 2.5 讨论 | 第45-50页 |
| 2.5.1 cueA/copA与铜抗性 | 第46-47页 |
| 2.5.2 脂多糖与重金属抗性 | 第47-48页 |
| 2.5.3 羧基末端酶与铜抗性 | 第48页 |
| 2.5.4 耐药性与重金属抗性 | 第48-50页 |
| 第三章P-TYPE ATPASE介导的铜抗性 | 第50-81页 |
| 3.1 引言 | 第50页 |
| 3.2 材料、试剂和仪器 | 第50-52页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第50-52页 |
| 3.2.2 主要试剂（盒） | 第52页 |
| 3.2.3 仪器及设备 | 第52页 |
| 3.3 实验方法 | 第52-62页 |
| 3.3.1 分子学生物操作 | 第52页 |
| 3.3.2 基因敲除 | 第52-54页 |
| 3.3.3 突变株生长测定及重金属耐受性分析 | 第54-55页 |
| 3.3.4 功能互补 | 第55页 |
| 3.3.5 N端His-rich区缺失分析 | 第55-56页 |
| 3.3.6 基因表达分析 | 第56-59页 |
| 3.3.7 基因cueA和csoR 5’cDNA末端扩增 | 第59-60页 |
| 3.3.8 启动子活性分析 | 第60-61页 |
| 3.3.9 结瘤试验 | 第61-62页 |
| 3.3.10 生物学信息学及统计分析 | 第62页 |
| 3.4 结果与分析 | 第62-78页 |
| 3.4.1 CueA生物信息学分析 | 第62-63页 |
| 3.4.2 CsoR生物信息学分析 | 第63-66页 |
| 3.4.3 启动子分析 | 第66-67页 |
| 3.4.4 基因cueA和csoR敲除 | 第67页 |
| 3.4.5 cueA在Bln0360的铜抗性中发挥重要的作用 | 第67-70页 |
| 3.4.6 Zn2+/Cd2+诱导csoR和cueA的表达 | 第70-71页 |
| 3.4.7 N端His-rich区缺失对CueA铜抗性功能的影响 | 第71-72页 |
| 3.4.8 CsoR负调节基因cueA的表达 | 第72-74页 |
| 3.4.9 csoR突变增加菌株对Cu、Zn和Cd的耐受性 | 第74-75页 |
| 3.4.10 CueA介导Zn和Cd的抗性 | 第75-76页 |
| 3.4.11 突变csoR或cue A对Bln0360结瘤能力的影响 | 第76-77页 |
| 3.4.12 CsoR调节铜转运P1B-type ATPase在慢生根瘤菌是保守的 | 第77-78页 |
| 3.5 讨论 | 第78-81页 |
| 第四章 COP操纵子介导的铜抗性 | 第81-109页 |
| 4.1 引言 | 第81页 |
| 4.2 材料、试剂和仪器 | 第81-83页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第81-83页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第83页 |
| 4.2.3 仪器及设备 | 第83页 |
| 4.3 实验方法 | 第83-93页 |
| 4.3.1 生物学信息学分析 | 第83-84页 |
| 4.3.2 分子学生物操作 | 第84页 |
| 4.3.3 缺失突变株构建 | 第84-85页 |
| 4.3.4 功能互补实验 | 第85-86页 |
| 4.3.5 重金属耐受性分析 | 第86-87页 |
| 4.3.6 基因表达分析 | 第87-88页 |
| 4.3.7 共转录验证 | 第88-89页 |
| 4.3.8 启动子活性分析 | 第89-93页 |
| 4.4 结果与分析 | 第93-106页 |
| 4.4.1 重金属耐受性分析结果 | 第93-95页 |
| 4.4.2 不同Cu2+浓度诱导下cop操纵子表达分析 | 第95-96页 |
| 4.4.3 Δ2213和 Δ2212互补分析 | 第96页 |
| 4.4.4 共转录验证 | 第96-97页 |
| 4.4.5 lacZ融合菌株构建 | 第97页 |
| 4.4.6 启动子鉴定 | 第97-99页 |
| 4.4.7 转录调控分析 | 第99-101页 |
| 4.4.8 生物信息学分析 | 第101-106页 |
| 4.5 讨论 | 第106-109页 |
| 第五章 结论与展望 | 第109-112页 |
| 5.1 结论 | 第109-110页 |
| 5.1.1 Bln0360通过多种途径抵御铜胁迫 | 第109页 |
| 5.1.2 CsoR负调控CueA的表达 | 第109页 |
| 5.1.3 CueA属于Cu+/Ag+转运ATPase，但能够介导Zn和Cd的抗性 | 第109页 |
| 5.1.4 2213、2212、copA、copB、copC和cusF 6 个基因组成一个操纵子与cueA协同作用维持Bln0360的铜抗性 | 第109-110页 |
| 5.1.5 基因2212和 2213为两个新的抗铜基因 | 第110页 |
| 5.1.6 cop操纵子是一个新的抗铜操纵子 | 第110页 |
| 5.2 创新点 | 第110-111页 |
| 5.3 展望及设想 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-124页 |
| 附录 | 第124-130页 |
| 缩略词 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 作者简介 | 第132页 |
