| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略语表 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-25页 |
| ·酯酶简介 | 第13页 |
| ·酯酶的结构特征 | 第13-15页 |
| ·酯酶的催化机制 | 第15-16页 |
| ·酯酶的来源 | 第16-17页 |
| ·酯酶的应用 | 第17-20页 |
| ·食品工业 | 第17-18页 |
| ·去污剂工业 | 第18-19页 |
| ·医药工业 | 第19页 |
| ·生物柴油 | 第19-20页 |
| ·造纸行业 | 第20页 |
| ·酯酶的酶活检测 | 第20-21页 |
| ·平板法 | 第20页 |
| ·滴定法 | 第20页 |
| ·光谱法 | 第20-21页 |
| ·酯酶的蛋白工程 | 第21-22页 |
| ·蛋白理性设计 | 第21页 |
| ·定向进化 | 第21-22页 |
| ·冷活性酶 | 第22-24页 |
| ·冷活性酶的来源 | 第23页 |
| ·冷活性酶的结构特征 | 第23-24页 |
| ·冷活性酶的应用 | 第24页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-41页 |
| ·材料 | 第25-28页 |
| ·菌株与质粒 | 第25页 |
| ·试剂 | 第25-26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·溶液 | 第26-27页 |
| ·仪器设备 | 第27-28页 |
| ·酯酶基因estS的克隆 | 第28-32页 |
| ·沙雷氏菌Serratia sp.基因组总DNA抽提 | 第28-29页 |
| ·酯酶基因estS的PCR扩增 | 第29-30页 |
| ·PCR产物纯化、酶切与回收 | 第30页 |
| ·载体pGEX-6p-1 的制备 | 第30页 |
| ·酶连 | 第30页 |
| ·大肠杆菌感受态制备 | 第30-31页 |
| ·电转化 | 第31页 |
| ·阳性克隆子检测 | 第31-32页 |
| ·酯酶EstS的表达与纯化 | 第32-34页 |
| ·酯酶EstS的诱导表达与纯化 | 第32-33页 |
| ·蛋白SDS-PAGE检测 | 第33-34页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第34页 |
| ·酯酶EstS酶学性质研究 | 第34-38页 |
| ·标准曲线绘制 | 第34-35页 |
| ·酯酶活性测定方法 | 第35页 |
| ·底物特异性测定 | 第35页 |
| ·酯酶最适反应温度测定 | 第35页 |
| ·酯酶温度稳定性测定 | 第35-36页 |
| ·酯酶最适pH测定 | 第36-37页 |
| ·酯酶pH稳定性测定 | 第37页 |
| ·金属离子及其他化学物质对酯酶活性的影响 | 第37页 |
| ·不同有机溶剂对酯酶活性的影响 | 第37页 |
| ·不同去污剂对酯酶活性的影响 | 第37页 |
| ·高浓度NaCl溶液对酯酶活性和稳定性的影响 | 第37-38页 |
| ·酯酶动力学研究 | 第38页 |
| ·酯酶三级结构模拟和分析 | 第38页 |
| ·estS随机突变文库的构建 | 第38-41页 |
| ·易错PCR扩增estS | 第38-39页 |
| ·易错PCR产物的纯化、酶切与回收 | 第39页 |
| ·酶连 | 第39页 |
| ·电转化 | 第39-40页 |
| ·文库质量检测 | 第40页 |
| ·随机突变文库的筛选 | 第40页 |
| ·突变蛋白的诱导表达和纯化 | 第40-41页 |
| ·突变酶的基本酶学性质测定 | 第41页 |
| ·突变酶的动力学常数测定 | 第41页 |
| ·突变酶的三维结构模拟 | 第41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-61页 |
| ·沙雷氏菌Serratia sp.基因组DNA的提取 | 第41-42页 |
| ·PCR扩增estS基因 | 第42-43页 |
| ·重组质粒pGEX-6p1estS的构建 | 第43页 |
| ·酯酶EstS序列分析 | 第43-45页 |
| ·EstS蛋白的表达和纯化 | 第45-46页 |
| ·EstS的酶学性质分析 | 第46-54页 |
| ·酯酶活性测定标准曲线 | 第46-47页 |
| ·底物特异性测定 | 第47页 |
| ·温度对酯酶活性和稳定性的影响 | 第47-48页 |
| ·不同pH对酯酶EstS活性和稳定性的影响 | 第48-49页 |
| ·金属离子和化合物对酯酶活性的影响 | 第49-50页 |
| ·有机溶剂对酯酶活性的影响 | 第50-51页 |
| ·去污剂对酯酶活性的影响 | 第51-52页 |
| ·NaCl溶液对酯酶活性和稳定的影响 | 第52页 |
| ·酯酶动力学常数 | 第52-53页 |
| ·酯酶蛋白三维结构模拟 | 第53-54页 |
| ·estS基因的随机突变库的构建 | 第54-61页 |
| ·易错PCR法扩增estS基因 | 第54-55页 |
| ·随机突变库重组质粒的检测 | 第55页 |
| ·突变体库突变频率的分析 | 第55-56页 |
| ·耐热性提高突变株的筛选 | 第56-57页 |
| ·1-D5 蛋白的表达和纯化 | 第57页 |
| ·突变体蛋白的酶学性质分析 | 第57-61页 |
| 4 讨论 | 第61-65页 |
| 参考文献 | 第65-73页 |
| 附录 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |