| 英文縮略词及中文对照表 | 第1-5页 |
| 目录 | 第5-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 1. 前言 | 第15-39页 |
| ·丝状真菌的遗传转化概述 | 第15-25页 |
| ·丝状真菌的遗传转化 | 第15-16页 |
| ·丝状真菌的转化方法 | 第16-25页 |
| ·原生质体-PEG转化 | 第16页 |
| ·醋酸锂转化法 | 第16-17页 |
| ·电击转化法 | 第17页 |
| ·基因枪转化法 | 第17页 |
| ·限制性内切酶介导的整合转化 | 第17-18页 |
| ·农杆菌介导的转化法 | 第18-25页 |
| ·嗜热真菌及其遗传转化 | 第25-26页 |
| ·嗜热真菌 | 第25-26页 |
| ·嗜热真菌的遗传转化 | 第26页 |
| ·蛋白激酶研究综述 | 第26-36页 |
| ·蛋白激酶概述 | 第26-28页 |
| ·蛋白激酶在细胞信号转导中的作用和意义 | 第26-27页 |
| ·蛋白激酶的调控机制 | 第27-28页 |
| ·真菌蛋白激酶的研究现状 | 第28-30页 |
| ·蛋白激酶在真菌信号传导中的作用 | 第28页 |
| ·丝状真菌蛋白激酶的种类及研究现状 | 第28-30页 |
| ·几种重要蛋白激酶研究概述 | 第30-35页 |
| ·蛋白激酶A | 第30-31页 |
| ·蛋白激酶C | 第31-34页 |
| ·促分裂蛋白激酶MAPK | 第34-35页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk | 第35-36页 |
| ·选题的目的意义,研究内容和技术路线 | 第36-39页 |
| ·目的意义 | 第36-37页 |
| ·研究内容 | 第37-38页 |
| ·技术路线 | 第38-39页 |
| 2. 材料和方法 | 第39-67页 |
| ·材料 | 第39-44页 |
| ·供试菌和转化质粒 | 第39页 |
| ·酶及生化试剂 | 第39页 |
| ·仪器 | 第39-40页 |
| ·溶液配制 | 第40-41页 |
| ·培养基 | 第41-44页 |
| ·农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化 | 第44-60页 |
| ·抑制疏绵状嗜热丝孢菌的抗生素种类及浓度的确定 | 第44-45页 |
| ·转化载体pROK Ⅱ-hygro的构建 | 第45-49页 |
| ·hygromycin cassette的获取 | 第45页 |
| ·hygromycin cassette片段的回收 | 第45-46页 |
| ·质粒pROK Ⅱ的酶切,回收 | 第46页 |
| ·片段连接 | 第46页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第46-47页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第47页 |
| ·大肠杆菌阳性克隆的鉴定 | 第47-48页 |
| ·质粒pROK Ⅱ-hygro的提取 | 第48-49页 |
| ·重组质粒pROK Ⅱ-hygro的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第49页 |
| ·重组质粒pROK Ⅱ-hygro转化农杆菌LBA4404受体细胞 | 第49-50页 |
| ·重组农杆菌的鉴定 | 第50页 |
| ·农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化 | 第50页 |
| ·转化条件变化对转化效率的影响 | 第50-51页 |
| ·农杆菌菌株的影响 | 第51页 |
| ·孢子萌发时间的影响 | 第51页 |
| ·受体菌孢子浓度的影响 | 第51页 |
| ·AS浓度的影响 | 第51页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的PCR分析 | 第51-52页 |
| ·转化子总DNA的提取(采用CATB/NaCl法) | 第51-52页 |
| ·PCR检测 | 第52页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的遗传稳定性测定 | 第52页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的southern杂交验证 | 第52-57页 |
| ·杂交探针的制备 | 第52-54页 |
| ·基因组DNA酶切 | 第54-55页 |
| ·电泳 | 第55页 |
| ·印迹(高盐转移法) | 第55-56页 |
| ·预杂交与杂交 | 第56页 |
| ·洗膜与显影 | 第56-57页 |
| ·T-DNA插入位点两侧翼序列的分离 | 第57-60页 |
| ·左边界侧翼序列的扩增 | 第57-59页 |
| ·右边界侧翼序列的扩增 | 第59-60页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌表型突变体的鉴定 | 第60页 |
| ·电击转化疏绵状嗜热丝孢菌 | 第60-61页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备 | 第60页 |
| ·质粒pUCATPH的提取 | 第60页 |
| ·电击转化 | 第60-61页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的PCR检测 | 第61页 |
| ·转化子总DNA的提取 | 第61页 |
| ·潮霉素基因的PCR检测 | 第61页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌表型突变体的鉴定 | 第61页 |
| ·农杆菌介导的蛋白激酶在洋葱表皮中的定位 | 第61-65页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk序列分析 | 第61-62页 |
| ·亚细胞定位载体pROK Ⅱ-GFP-pspk的构建 | 第62-64页 |
| ·引物设计 | 第62页 |
| ·片段的扩增 | 第62页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第62-63页 |
| ·PCR产物及质粒的酶切 | 第63页 |
| ·酶切产物的纯化及连接 | 第63页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化及转化子的验证 | 第63页 |
| ·重组质粒pROK Ⅱ-GFP-pspk的提取 | 第63-64页 |
| ·重组质粒电击转化农杆菌LBA4404及重组子的鉴定 | 第64-65页 |
| ·电击法农杆菌感受态细胞的制备 | 第64页 |
| ·电击法转化农杆菌 | 第64页 |
| ·重组农杆菌鉴定 | 第64-65页 |
| ·农杆菌介导的蛋白激酶在洋葱表皮细胞中的定位 | 第65页 |
| ·农杆菌的诱导培养 | 第65页 |
| ·洋葱表皮的预培养 | 第65页 |
| ·洋葱表皮细胞的培养与侵染 | 第65页 |
| ·转化结果的观察 | 第65页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk敲除载体的构建 | 第65-67页 |
| ·引物设计 | 第65-66页 |
| ·片段的扩增 | 第66页 |
| ·双酶切反应 | 第66页 |
| ·酶切产物的纯化,连接,转化,重组子的鉴定及质粒提取 | 第66-67页 |
| 3. 结果与分析 | 第67-93页 |
| ·农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌的转化 | 第67-77页 |
| ·抑制疏绵状嗜热丝孢菌生长的抗生素种类及浓度的测定结果 | 第67-68页 |
| ·转化载体pROK Ⅱ-hygro的构建 | 第68-70页 |
| ·pROK Ⅱ-hygro载体构建图谱 | 第68页 |
| ·质粒pUCATPH和pROK Ⅱ的酶切产物 | 第68-69页 |
| ·潮霉素抗性基因片段hph的PCR检测 | 第69-70页 |
| ·重组质粒pROK Ⅱ-hygro的酶切验证 | 第70页 |
| ·转化条件变化对转化效率的影响 | 第70-73页 |
| ·农杆菌菌株的影响 | 第70-71页 |
| ·孢子萌发时间的影响 | 第71-72页 |
| ·受体菌孢子浓度的影响 | 第72页 |
| ·乙酰丁香酮浓度的影响 | 第72-73页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的PCR分析 | 第73-74页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的遗传稳定性测定 | 第74页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的Southern杂交验证 | 第74-75页 |
| ·T-DNA序列插入位点两侧翼序列的特征分析 | 第75-76页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌表型突变体的鉴定 | 第76-77页 |
| ·电击转化疏绵状嗜热丝孢菌 | 第77-78页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌原生质体的制备 | 第77页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌转化子的PCR验证 | 第77-78页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌表型突变体的筛选 | 第78页 |
| ·农杆菌介导的蛋白激酶在洋葱表皮中的定位 | 第78-83页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk序列分析 | 第78-80页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk的信号肽分析 | 第79页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk的亚细胞定位预测 | 第79-80页 |
| ·亚细胞定为载体pROK Ⅱ-GFP-pspk的构建 | 第80-82页 |
| ·载体pROK Ⅱ-GFP-pspk的构建图谱 | 第80页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk编码区的分离 | 第80-81页 |
| ·pROK Ⅱ-GFP-pspk载体的构建及鉴定 | 第81-82页 |
| ·农杆菌重组子的鉴定 | 第82页 |
| ·蛋白激酶pspk亚细胞定位结果 | 第82-83页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk敲除载体的构建 | 第83-93页 |
| ·酶切位点分析 | 第83-84页 |
| ·引物设计 | 第84-85页 |
| ·SPK和XPK的分离 | 第85-86页 |
| ·基因敲除载体pUCATPH/PK和pROK Ⅱ-hygro/PK的构建 | 第86-88页 |
| ·基因敲除载体pUCATPH/PK和pROK Ⅱ-hygro/PK的验证 | 第88-93页 |
| ·pMD18-T/SPK和pMD18-T/XPK的酶切验证 | 第88页 |
| ·载体pUCATPH/XPK的验证 | 第88-89页 |
| ·载体pUCATPH/PK的验证 | 第89-91页 |
| ·基因敲除载体pROK Ⅱ-hygro/PK的验证 | 第91-93页 |
| 4 讨论 | 第93-98页 |
| ·农杆菌介导的疏绵状嗜热丝孢菌的转化 | 第93-96页 |
| ·农杆菌菌株对转化的影响 | 第93页 |
| ·孢子的萌发时间对转化的影响 | 第93-94页 |
| ·乙酰丁香酮对转化的影响 | 第94页 |
| ·共培养时间对转化效率的影响 | 第94-95页 |
| ·农杆菌和受体菌浓度对转化的影响 | 第95-96页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌蛋白激酶基因pspk在洋葱表皮中的定位 | 第96页 |
| ·基因敲除载体的构建 | 第96-98页 |
| 5 结论和建议 | 第98-100页 |
| ·结论 | 第98-99页 |
| ·建议 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第112页 |
