| 目录 | 第1-7页 |
| 第一部分 PIH1激活rRNA转录机制的研究 | 第7-63页 |
| 缩写词表 | 第7-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-17页 |
| 材料方法 | 第17-38页 |
| 一、试剂与材料 | 第17-19页 |
| 二、菌株、细胞株和质粒 | 第19-20页 |
| 三、主要实验方法 | 第20-38页 |
| (一) 感受态大肠杆菌的制备 | 第20页 |
| (二) 质粒DNA的转化 | 第20页 |
| (三) 质粒DNA的碱法小量制备 | 第20-21页 |
| (四) 质粒DNA的大量制备 | 第21页 |
| (五)琼脂糖凝胶制备及电泳 | 第21页 |
| (六) 限制性内切酶的酶切反应 | 第21页 |
| (七) 从琼脂糖凝胶中同收DNA片段 | 第21-22页 |
| (八) DNA片段的连接 | 第22页 |
| (九) 质粒定点突变 | 第22页 |
| (十)细胞培养 | 第22-23页 |
| (十一) 细胞处理 | 第23页 |
| (十二) 细胞冻存和复苏 | 第23页 |
| (十三) 质粒转染细胞 | 第23-24页 |
| (十四) 细胞总RNA的制备 | 第24-25页 |
| (十五) RT-PCR以及PCR扩增 | 第25页 |
| (十六) 双报告基因检测人rDNA基因启动子(pHrD-IRES-luc)的活性 | 第25-26页 |
| (十七) Real-time RT-PCR | 第26页 |
| (十八) 染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP) | 第26-27页 |
| (十九) 基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| (二十) 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation) | 第28页 |
| (二十一) GST-PULL DOWN | 第28-29页 |
| (二十二) 体外结合实验 | 第29页 |
| (二十三) Tandem Affinity Purificaion(TAP) | 第29页 |
| (二十四) 免疫荧光分析 | 第29-31页 |
| (二十五) 多组织Northern膜杂交 | 第31页 |
| (二十六) Western印迹分析 | 第31-34页 |
| (二十七) 原核表达纯化组蛋白 | 第34-35页 |
| (二十八) 核仁提取 | 第35-36页 |
| (二十九) Peptide pulldown | 第36页 |
| (三十) Nuclear runon | 第36-38页 |
| 结果 | 第38-60页 |
| 一、PIH1—SNF5结合蛋白 | 第38-40页 |
| 1、体内体外验证PIH1和SNF5结合 | 第38页 |
| 2、PIH1和SNF5共定位于细胞核内 | 第38-39页 |
| 3、PIH1的组织分布 | 第39页 |
| 4、PIH1通过SNF5和SWI/SNF染色质重塑复合物ATP酶亚基Brg1相互作用 | 第39-40页 |
| 二、PIH1激活rRNA基因转录 | 第40-42页 |
| 1、PIH1,SNF5以及Brg促进核糖体RNA基因表达升高 | 第40页 |
| 2、PIH1促进rRNA基因转录 | 第40-41页 |
| 3、检测核仁中PIH1及SWI/SNF核心组分SNF5,Brg1的分布 | 第41-42页 |
| 三、PIH1通过SNF5和Brg1活化rDNA启动子区的染色质状态 | 第42-46页 |
| 四、PIH1与组蛋白H4结合 | 第46-51页 |
| 1、PIH1与组蛋白H4结合 | 第46-47页 |
| 2、组蛋白H4 16位赖氨酸对结合PIH1起关键作用 | 第47-48页 |
| 3、PIH1与TIP5竞争性结合于H4K16位点 | 第48-51页 |
| 五、PIH1 N端54位苯丙氨酸(F54)为激活rDNA转录所必需 | 第51-55页 |
| 1、PIH1的N端61个氨基酸是其激活rDNA转录的关键部分 | 第51页 |
| 2、P1H1 F54位点突变降低与H4结合能力 | 第51-53页 |
| 3、PIH1点突变不影响与SNF5的结合 | 第53-54页 |
| 4、PIH1 54位苯丙氨酸是其发挥功能所必需 | 第54-55页 |
| 六、PIH1在高糖诱导rRNA基因转录中的功能 | 第55-60页 |
| 1、高糖诱导pre-rRNA表达显著增加 | 第55-56页 |
| 2、葡萄糖诱导rRNA基因启动子区染色质修饰变化 | 第56-57页 |
| 3、葡萄糖通过PIH1促使rDNA启动子区染色质修饰改变 | 第57-60页 |
| 讨论 | 第60-62页 |
| 小结 | 第62-63页 |
| 第二部分 染色质体外组装和转录平台的建立 | 第63-84页 |
| 中文摘要 | 第63-64页 |
| Abstract | 第64-65页 |
| 前言 | 第65-67页 |
| 材料方法 | 第67-79页 |
| 一、试剂与材料 | 第67页 |
| 二、菌株、细胞株和质粒 | 第67-68页 |
| 三、主要实验方法 | 第68-79页 |
| (一) 提取核抽提物 | 第68-69页 |
| (二)原核表达纯化组蛋白八聚体 | 第69-71页 |
| (三) 提取HeLa细胞组蛋白八聚体 | 第71-73页 |
| (四) Sf9细胞的培养和保存 | 第73-74页 |
| (五) 昆虫表达纯化NAP-1 | 第74-75页 |
| (六) 昆虫表达纯化ACF | 第75页 |
| (七) 染色质体外组装及转录 | 第75-79页 |
| 实验结果 | 第79-83页 |
| 1、提取HeLa细胞核心组蛋白八聚体 | 第79页 |
| 2、NAP-1蛋白表达纯化 | 第79页 |
| 3、ACF的表达纯化 | 第79页 |
| 4、原核表达纯化GAL4-VP16融合蛋白 | 第79-80页 |
| 5、原核表达纯化组蛋白 | 第80页 |
| 6、利用纯化的蛋白进行染色质体外组装 | 第80-81页 |
| 7、利用细胞核抽提物进行质粒模板体外转录 | 第81-83页 |
| 小结 | 第83-84页 |
| 文献综述 | 第84-88页 |
| 参考文献 | 第88-94页 |
| 致谢 | 第94-97页 |
| 个人简历 | 第97页 |
