| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 前言 | 第11-16页 |
| 实验材料 | 第16-28页 |
| 一、大肠杆菌菌株 | 第16页 |
| 二、酵母菌株 | 第16页 |
| 三、细胞株 | 第16页 |
| 四、质粒 | 第16-18页 |
| 五、引物 | 第18-20页 |
| 六、工具酶及分子量标准 | 第20页 |
| 七、主要试剂 | 第20-22页 |
| 八、主要溶液 | 第22-25页 |
| 九、主要培养基 | 第25-27页 |
| 十、主要仪器设备 | 第27-28页 |
| 实验方法 | 第28-48页 |
| 一、TRIzol法提取真核细胞总RNA | 第28页 |
| 二、两步法RT-PCR反应 | 第28-29页 |
| 三、PCR扩增 | 第29-31页 |
| 四、DNA片段的回收纯化 | 第31页 |
| 五、DNA酶切 | 第31页 |
| 六、载体去磷酸化 | 第31-32页 |
| 七、DNA的修饰 | 第32页 |
| 九、E.coli感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 十、E.coli质粒转化 | 第32-33页 |
| 十一、碱裂解法小量提取质粒DNA | 第33页 |
| 十二、试剂盒法快速提取小量质粒DNA | 第33-34页 |
| 十三、质粒DNA的大量制备 | 第34页 |
| 十四、质粒的定量 | 第34-35页 |
| 十五、Tris-甘氨酸-SDS-PAGE | 第35页 |
| 十六、SDS-PAGE凝胶染色 | 第35页 |
| 十七、E.coli菌种的保存 | 第35页 |
| 十八、E.coli源蛋白的温控诱导表达 | 第35-36页 |
| 十九、E.coli外源蛋白的IPTG诱导表达 | 第36页 |
| 二十、E.coli’蛋白表达鉴定 | 第36页 |
| 二十一、E.coli可溶性表达蛋白的提取 | 第36-37页 |
| 二十二、E.coli包涵体的提取 | 第37页 |
| 二十三、酵母转化质粒的制备 | 第37页 |
| 二十四、酵母质粒转化——电转法 | 第37-38页 |
| 二十五、酵母细胞质粒转化——改进的电转法 | 第38页 |
| 二十六、GS115转化子表型的筛选 | 第38-39页 |
| 二十七、G148抗性酵母转化子的筛选 | 第39页 |
| 二十八、酵母蛋白表达转化子的筛选 | 第39页 |
| 二十九、三氯乙酸-脱氧胆酸(TCA-DOC)蛋白沉淀法 | 第39-40页 |
| 三十、融合基因整合入酵母基因组的PCR鉴定 | 第40页 |
| 三十一、酵母基因组的提取 | 第40-41页 |
| 三十二、酵母菌种的保存 | 第41页 |
| 三十三、酵母分泌表达蛋白的诱导与制备 | 第41页 |
| 三十四、亲和层析纯化蛋白 | 第41-42页 |
| 三十五、透析袋的处理 | 第42页 |
| 三十六、肠激酶切割 | 第42页 |
| 三十七、蛋白质含量的测定 | 第42-44页 |
| 三十八、Western蛋白印记杂交 | 第44页 |
| 三十九、细胞的复苏 | 第44页 |
| 四十、细胞的传代培养 | 第44-45页 |
| 四十一、细胞的计数 | 第45页 |
| 四十二、细胞的冻存 | 第45页 |
| 四十三、蛋白活性测定 | 第45-46页 |
| 四十四、MTT比色法检测细胞毒性 | 第46页 |
| 四十五、细胞凋亡荧光染色 | 第46页 |
| 四十六、细胞内源caspase激活实验 | 第46-47页 |
| 四十七、细胞凋亡的流式分析 | 第47-48页 |
| 实验流程 | 第48-49页 |
| 酵母表达蛋白流程 | 第49-50页 |
| 实验结果 | 第50-184页 |
| 第一部分 目的基因GrB及其突变型的获取与表达重组体的构建 | 第50-90页 |
| 一、目的基因GrB的获取与改造 | 第50-54页 |
| 二、E.coli原核表达重组体的构建 | 第54-69页 |
| 三、毕赤酵母真核表达重组体的构建 | 第69-90页 |
| 第二部分 GrB及其突变与靶向融合蛋白的表达与纯化 | 第90-129页 |
| 一、融合基因在E.coli中的表达与纯化 | 第90-104页 |
| 二、融合基因在毕赤酵母中的表达与纯化 | 第104-129页 |
| 第三部分 GrB及其突变与靶向融合蛋白的生物学功能探讨 | 第129-184页 |
| 一、GrB及其突变与靶向蛋白的酶促活性检测 | 第129-144页 |
| 二、GrB及其突变与靶向融合蛋白的细胞毒活性分析 | 第144-168页 |
| 三、GrB靶向融合蛋白结构域功能分析 | 第168-175页 |
| 四、GrB及其突变与靶向融合蛋白诱导细胞凋亡的检测 | 第175-178页 |
| 五、GrB及其突变与靶向融合蛋白诱导细胞凋亡的机制探讨 | 第178-184页 |
| 讨论 | 第184-199页 |
| 一、课题设计 | 第184页 |
| 二、靶向蛋白的选择 | 第184-185页 |
| 三、杀伤效应蛋白的选择 | 第185-187页 |
| 四、GrB的改造 | 第187页 |
| 五、靶向融合基因的构建 | 第187-188页 |
| 六、目的蛋白在E.coli中的表达与纯化 | 第188-192页 |
| 七、目的蛋白在酵母中的表达与纯化 | 第192-196页 |
| 八、氯喹与目的蛋白的协同作用 | 第196-197页 |
| 九、蛋白mGrBLG的生物活性 | 第197-199页 |
| 小结 | 第199-202页 |
| 参考文献 | 第202-210页 |
| 综述1 | 第210-217页 |
| 综述2 | 第217-224页 |
| 致谢 | 第224-225页 |
