| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-16页 |
| ·几丁质酶的研究历史 | 第12-13页 |
| ·几丁质酶的研究现状 | 第13-16页 |
| ·几丁质酶的分子量 | 第13页 |
| ·几丁质酶的pI和最适pH | 第13页 |
| ·几丁质酶的最适温度 | 第13-14页 |
| ·几丁质酶基因的克隆现状 | 第14页 |
| ·几丁质酶的应用研究现状 | 第14-16页 |
| 2.材料与方法 | 第16-31页 |
| ·材料 | 第16-23页 |
| ·菌株 | 第16页 |
| ·质粒 | 第16页 |
| ·参考品 | 第16页 |
| ·蛋白标准品 | 第16页 |
| ·限制性内切酶及工具酶 | 第16页 |
| ·试剂盒 | 第16页 |
| ·核酸及蛋白分子量标准 | 第16-19页 |
| ·引物 | 第19-20页 |
| ·主要仪器和层析柱 | 第20页 |
| ·主要试剂 | 第20-21页 |
| ·主要培养基 | 第21页 |
| ·主要溶液 | 第21-23页 |
| ·方法 | 第23-31页 |
| ·CTS1-2基因引物的设计与钓取 | 第23页 |
| ·重组质粒pPIC9-CTS1-2单拷贝基因的构建 | 第23-24页 |
| ·重组质粒pPIC9-信号肽+CTS1-2单拷贝基因的构建 | 第24页 |
| ·重组质粒pPICZα-CTS1-2多拷贝基因的构建 | 第24页 |
| ·表达载体的鉴定 | 第24-25页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌的PEG-1000转化 | 第25-26页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌的电转化 | 第26-27页 |
| ·巴斯德毕赤酵母重组子甲醇利用表型的鉴定 | 第27页 |
| ·巴斯德毕赤酵母转化子在摇瓶里的诱导表达 | 第27页 |
| ·外标法测定CTS1-2在培养上清中的表达水平 | 第27-28页 |
| ·重组CTS1-2的纯化 | 第28页 |
| ·凝胶柱分析重组CTS1-2纯品的表观分子量 | 第28-29页 |
| ·用Lowry法测定重组CTS1-2蛋白质的浓度 | 第29页 |
| ·重组CTS1-2的生物活性测定 | 第29-30页 |
| ·荧光比色法测活 | 第29页 |
| ·DNS法测活 | 第29-30页 |
| ·TLC分析 | 第30-31页 |
| 3.结果 | 第31-53页 |
| ·用酿酒酵母基因组经PCR克隆CTS1-2的基因 | 第31-33页 |
| ·重组质粒pPIC9-CTS1-2单拷贝基因的构建 | 第33-34页 |
| ·重组质粒pPICZα-CTS1-2四拷贝基因的构建 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pPIC9K-CTS1-2单拷贝基因的构建 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pPIC9-信号肽+CTS1-2单拷贝基因的构建 | 第36-39页 |
| ·表达载体的鉴定 | 第39-40页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的转化及转化子的甲醇利用表型筛选 | 第40-42页 |
| ·pPIC9-CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选 | 第40-41页 |
| ·四拷贝表达载体pPICZα-CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选与pPIC9-CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选结果的比较 | 第41页 |
| ·pPIC9K-CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选与pPIC9-CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选结果的比较 | 第41-42页 |
| ·pPIC9-信号肽+CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选与pPIC9-CTS1-2／GS115工程菌株表达克隆的筛选结果的比较 | 第42页 |
| ·巴斯德毕赤酵母转化子在摇瓶里的诱导表达 | 第42-47页 |
| ·表达水平的筛选 | 第42-43页 |
| ·CTS1-2的硫酸铵沉淀 | 第43页 |
| ·CTS1-2的Q柱层析 | 第43-44页 |
| ·CTS1-2的亲和层析 | 第44页 |
| ·用蛋白外标法确定培养上清中CTS1-2的表达水平 | 第44页 |
| ·重组CTS1-2样品N端氨基酸残基的测定 | 第44-46页 |
| ·pPIC9-CTS1-2／GS115工程菌株的摇瓶培养 | 第46页 |
| ·Lowry法测定重组CTS1-2的蛋白质浓度 | 第46-47页 |
| ·凝胶柱分析重组CTS1-2纯品的表观分子量 | 第47页 |
| ·温度对酶活性的影响 | 第47-48页 |
| ·pH对酶活性的影响 | 第48-49页 |
| ·重组CTS1-2的生物活性测定 | 第49页 |
| ·酶动力学研究 | 第49-50页 |
| ·几丁质酶对于黑曲霉的生长抑制 | 第50-51页 |
| ·几丁质酶胶体几丁质的降解 | 第51页 |
| ·几丁质酶降解胶体几丁质的产物分析 | 第51-53页 |
| 4.讨论 | 第53-57页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统及对表达产物CTS1-2蛋白的降解 | 第53页 |
| ·增加外源基因的整合拷贝数和改变信号肽 | 第53-54页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌的转化方法 | 第54-55页 |
| ·巴斯德毕赤酵母工程菌发酵条件的优化 | 第55-56页 |
| ·重组CTS1-2的纯化 | 第56页 |
| ·重组CTS1-2的活性检测 | 第56-57页 |
| 5.结论 | 第57-58页 |
| 6.参考文献 | 第58-64页 |
| 7.致谢 | 第64-65页 |
| 8.综述 | 第65-77页 |
| 9 附录1 缩略词表 | 第77页 |
