| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 符号与缩略语说明 | 第15-17页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-68页 |
| 1 芽孢杆菌表达系统发展简史 | 第18-19页 |
| 2 芽孢杆菌表达系统概述 | 第19-39页 |
| ·芽孢杆菌表达系统的特点 | 第19-20页 |
| ·芽孢杆菌表达系统的宿主菌株 | 第20-24页 |
| ·枯草杆菌宿主菌株 | 第20-22页 |
| ·短短小芽孢杆菌宿主菌株 | 第22-24页 |
| ·可作为宿主的其他种 | 第24页 |
| ·芽孢杆菌表达系统的载体 | 第24-32页 |
| ·自主复制载体 | 第24-26页 |
| ·染色体整合载体 | 第26-31页 |
| ·噬菌体载体 | 第31页 |
| ·芽孢杆菌载体举例 | 第31-32页 |
| ·芽孢杆菌的转化方法概述 | 第32-39页 |
| ·感受态转化 | 第32-37页 |
| ·原生质体转化 | 第37-39页 |
| ·碱金属离子转化法 | 第39页 |
| ·电转化 | 第39页 |
| ·质粒的其它转移方式 | 第39页 |
| 3 芽孢杆菌表达系统的基因表达概述 | 第39-54页 |
| ·芽孢杆菌基因表达的特点 | 第39-51页 |
| ·能够形成芽孢 | 第39-40页 |
| ·多Sigma因子 | 第40-41页 |
| ·启动子的特征 | 第41-42页 |
| ·终止子 | 第42页 |
| ·16S RNA 3’端序列 | 第42-43页 |
| ·革兰氏染色与基因表达 | 第43页 |
| ·外源蛋白的分泌表达 | 第43-49页 |
| ·外源蛋白的细胞内表达 | 第49-50页 |
| ·单基因受多调控基因调控 | 第50-51页 |
| ·一个调控基因往往影响多个基因的表达 | 第51页 |
| ·芽孢杆菌表达系统中已表达的基因 | 第51-54页 |
| ·已表达的真核基因 | 第51-52页 |
| ·已表达的原核基因 | 第52-53页 |
| ·蛋白质工程 | 第53-54页 |
| 4 枯草杆菌表达系统存在问题及今后发展方向 | 第54-57页 |
| ·关于表达真核基因方面 | 第54-55页 |
| ·关于表达酶的方面 | 第55页 |
| ·关于表达杀虫晶体蛋白(ICP)方面 | 第55页 |
| ·关于致病菌炭疽芽孢杆菌方面 | 第55-56页 |
| ·利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强芽孢杆菌在各方面的应用 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-68页 |
| 第二章 枯草杆菌高效表达和分泌系统的建立及mpd基因的重组分泌表达 | 第68-116页 |
| 第一节 以mpd为报告基因的新型启动子探针载体的构建及应用 | 第70-86页 |
| 1 材料与方法 | 第70-74页 |
| ·菌株,质粒及培养基 | 第70页 |
| ·酶、抗生素和化学试剂 | 第70页 |
| ·大肠杆菌普通感受态细胞的制备及转化 | 第70-71页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第71页 |
| ·质粒DNA的小量酶切 | 第71页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因mpd的扩增 | 第71页 |
| ·启动子探针的构建 | 第71-72页 |
| ·枯草杆菌1A1基因组DNA的提取 | 第72页 |
| ·枯草杆菌基因组DNA启动子文库的构建及启动子克隆 | 第72页 |
| ·甲基对硫磷水解酶酶活力单位的定义及酶活测定 | 第72-74页 |
| ·酶活力单位定义 | 第73页 |
| ·酶活测定原理 | 第73页 |
| ·酶活测定步骤 | 第73页 |
| ·酶活的计算方法 | 第73-74页 |
| ·启动子片段的测序和分析 | 第74页 |
| 2 结果与分析 | 第74-84页 |
| ·mpd基因片断的扩增及启动子探针的构建 | 第74-77页 |
| ·枯草杆菌基因组DNA的提取和部分酶切条件的建立 | 第77页 |
| ·基因组DNA启动子基因文库的构建及强启动子片断的克隆 | 第77-80页 |
| ·启动子片段的序列测定及分析 | 第80-84页 |
| 3 讨论 | 第84-86页 |
| 第二节 利用枯草杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组表达mpd基因 | 第86-98页 |
| 1 材料与方法 | 第86-91页 |
| ·菌株和质粒 | 第86页 |
| ·酶和引物 | 第86页 |
| ·培养基 | 第86页 |
| ·枯草杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第86-87页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第87-88页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶的灌制 | 第87页 |
| ·电泳 | 第87页 |
| ·凝胶的染色及脱色 | 第87-88页 |
| ·甲基对硫磷水解酶的酶谱(Zymogram)分析 | 第88页 |
| ·mpd基因的克隆及穿梭启动子探针的构建 | 第88页 |
| ·穿梭表达载体pNYTM和pNYWM的构建 | 第88页 |
| ·枯草杆菌1A751表达菌株的构建 | 第88-89页 |
| ·穿梭载体pUBC19的构建 | 第89页 |
| ·利用ytkA启动子和nprB信号肽编码序列构建分泌表达载体 | 第89-90页 |
| ·枯草杆菌WB800表达菌株的构建 | 第90页 |
| ·甲基对硫磷水解酶(MPH)活性检测及活力测定 | 第90页 |
| ·枯草杆菌表达菌株的发酵试验 | 第90-91页 |
| ·重组表达MPH的SDS-PAGE检测和酶谱分析 | 第91页 |
| 2 结果与分析 | 第91-97页 |
| ·穿梭启动子探针pNW33N-mpd的构建和鉴定 | 第91-92页 |
| ·穿梭表达载体pNYTM和pNYWM的构建和转化 | 第92页 |
| ·枯草杆菌表达菌株甲基对硫磷水解酶表达活性的定性检测 | 第92-93页 |
| ·表达菌株B.subtilis 1A751(pNYTM)和1A751(pNYWM)的发酵试验 | 第93-94页 |
| ·分泌表达载体pYNMK的构建和转化 | 第94-95页 |
| ·表达菌株WB800(pYNMK)的发酵试验及重组MPH分析 | 第95-97页 |
| 3 讨论 | 第97-98页 |
| 第三节 利用P_(43)启动子和NprB信号肽编码序列构建高效分泌表达载体重组表达mpd基因 | 第98-111页 |
| 1 材料与方法 | 第98-102页 |
| ·菌株和质粒 | 第98页 |
| ·酶和引物 | 第98页 |
| ·培养基 | 第98页 |
| ·P43启动子与NprB信号肽编码序列的克隆及融合 | 第98-99页 |
| ·穿梭分泌表达载体pP43NMK的构建 | 第99页 |
| ·表达菌株WB800(pP43NMK)的构建 | 第99页 |
| ·表达菌株WB800(pP43NMK)的摇瓶发酵试验 | 第99-100页 |
| ·MPH的SDS-PAGE和酶谱分析 | 第100页 |
| ·重组表达MPH的分离和纯化 | 第100-101页 |
| ·样品的制备和预处理 | 第100页 |
| ·二乙氨基-乙基-葡萄糖凝胶A-50(DEAE-Sephadex A-50)的预处理 | 第100页 |
| ·装柱 | 第100页 |
| ·加样及洗脱 | 第100-101页 |
| ·收集 | 第101页 |
| ·洗脱曲线的绘制 | 第101页 |
| ·合并与浓缩 | 第101页 |
| ·A-50凝胶的再生 | 第101页 |
| ·MPH的电洗脱纯化 | 第101页 |
| ·重组表达MPH的鉴定 | 第101-102页 |
| 2 结果与分析 | 第102-110页 |
| ·穿梭表达载体pP43NMK的构建 | 第102-103页 |
| ·MPH在WB800(pP43NMK)中的重组表达和分泌 | 第103-105页 |
| ·重组表达MPH的酶谱分析 | 第105-106页 |
| ·重组表达MPH的纯化和鉴定 | 第106-110页 |
| 3 讨论 | 第110-111页 |
| 本章小结 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-116页 |
| 第三章 短短小芽孢杆菌cwp基因强启动子的克隆及应用 | 第116-124页 |
| 1 材料和方法 | 第116-118页 |
| ·菌株和质粒 | 第116页 |
| ·酶和引物 | 第116页 |
| ·培养基 | 第116页 |
| ·短短小芽孢杆菌B15总DNA的提取 | 第116-117页 |
| ·分子操作 | 第117页 |
| ·细胞壁蛋白基因(cwp)启动子和信号肽编码保守序列的扩增 | 第117页 |
| ·PCR产物的克隆和测序 | 第117页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因(mpd)穿梭分泌表达载体的构建和转化 | 第117页 |
| ·枯草杆菌表达菌株的构建 | 第117页 |
| ·甲基对硫磷水解酶(MPH)活性检测及活力测定 | 第117页 |
| ·枯草杆菌WB800(pP15MK)的发酵试验 | 第117-118页 |
| 2 结果和分析 | 第118-121页 |
| ·启动子和信号肽编码序列的扩增,克隆及分析 | 第118页 |
| ·甲基对硫磷水解酶基因穿梭分泌表达载体的构建 | 第118-119页 |
| ·表达菌株甲基对硫磷水解酶表达活性的定性检测 | 第119-120页 |
| ·表达菌株B.subtilis WB800(pP15MK)的发酵试验 | 第120-121页 |
| 3 讨论 | 第121-122页 |
| 4 本章小结 | 第122页 |
| 参考文献 | 第122-124页 |
| 第四章 枯草杆菌新型通用无标记同源重组系统的建立及应用 | 第124-140页 |
| 1 材料和方法 | 第126-130页 |
| ·菌株和质粒 | 第126-127页 |
| ·酶和引物 | 第127页 |
| ·培养基 | 第127页 |
| ·淀粉酶活性的检测 | 第127页 |
| ·分子生物学操作 | 第127-128页 |
| ·载体pDGIEF的构建 | 第128页 |
| ·载体pDGIEF-mpd的构建 | 第128页 |
| ·载体pIEFBPR的构建 | 第128-130页 |
| ·载体pIEFBPR-ID的构建 | 第130页 |
| ·甲基对硫磷水解酶活性的检测 | 第130页 |
| 2 结果和分析 | 第130-137页 |
| ·以mazF基因为反向筛选标记的同源重组载体pDGIEF的构建 | 第130-132页 |
| ·MazF cassette的在枯草杆菌1A751染色体上的整合和删除 | 第132-135页 |
| ·mpd基因在枯草杆菌BS752S中的整合表达 | 第135-136页 |
| ·通用型同源重组整合载体的构建 | 第136页 |
| ·枯草杆菌BS753S的bpr基因的in-frame删除 | 第136-137页 |
| 3 讨论 | 第137页 |
| 4 本章小结 | 第137-138页 |
| 参考文献 | 第138-140页 |
| 第五章 pUB110衍生质粒在芽孢杆菌间的转移现象及其应用 | 第140-150页 |
| 1 材料和方法 | 第140-142页 |
| ·菌株和质粒 | 第140-141页 |
| ·培养基及试剂 | 第141页 |
| ·枯草杆菌感受态细胞的制备 | 第141页 |
| ·枯草杆菌质粒的提取 | 第141页 |
| ·甲基对硫磷水解酶(MPH)活性检测 | 第141页 |
| ·菌株胞外蛋白酶活性的检测 | 第141页 |
| ·重组质粒的转移 | 第141-142页 |
| 2 结果和分析 | 第142-146页 |
| ·pUB110衍生质粒在枯草杆菌之间的转移 | 第142-144页 |
| ·mpd基因在野生芽孢杆菌中的表达 | 第144-146页 |
| 3 讨论 | 第146-148页 |
| 4 本章小结 | 第148页 |
| 参考文献 | 第148-150页 |
| 第六章 全文总结 | 第150-154页 |
| 1 全文研究内容总结、讨论与展望 | 第150-152页 |
| 2 本论文研究的主要创新点 | 第152-154页 |
| 附录 | 第154-180页 |
| 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂 | 第154-156页 |
| 附录2 枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂 | 第156页 |
| 附录3 甲基对硫磷酶活测定所用仪器及试剂 | 第156-157页 |
| 附录4 相关载体序列 | 第157-180页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第180-182页 |
| 致谢 | 第182页 |
