| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-61页 |
| ·研究目的和意义 | 第20-21页 |
| ·细菌蛋白转运的主要途径 | 第21-26页 |
| ·Sec途径 | 第22-23页 |
| ·Tat途径 | 第23-24页 |
| ·SRP途径 | 第24-25页 |
| ·三种主要途径的差别 | 第25-26页 |
| ·蛋白经SRP途径的靶向转运 | 第26-49页 |
| ·信号肽 | 第27页 |
| ·SRP途径的分子机制 | 第27-32页 |
| ·真核生物SRP途径 | 第27-28页 |
| ·细菌SRP途径 | 第28-29页 |
| ·SRP的保守性 | 第29-32页 |
| ·SRP的结构与功能 | 第32-35页 |
| ·SRP组分的结构数据 | 第32-33页 |
| ·SRP的核心是动态的 | 第33-34页 |
| ·M结构域结构基础 | 第34页 |
| ·细菌SRP对底物的识别 | 第34-35页 |
| ·SRP调控翻译作用 | 第35页 |
| ·SRP受体 | 第35-39页 |
| ·真核细胞SRP受体 | 第35-36页 |
| ·原核细胞SRP受体 | 第36-39页 |
| ·SRP组分RNA | 第39-41页 |
| ·SRP与其受体的相互作用 | 第41-42页 |
| ·SRP组分与其他蛋白相互作用 | 第42-44页 |
| ·SRP与靶向信号的相互作用 | 第44页 |
| ·SRP与核糖体以及核糖体新生肽链结合 | 第44-45页 |
| ·GTP在SRP途径中的作用 | 第45-47页 |
| ·链霉菌SRP途径的研究进展 | 第47-49页 |
| ·展望 | 第49-51页 |
| ·论文立题依据和研究内容 | 第51-53页 |
| ·立题依据 | 第51-52页 |
| ·研究内容 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-61页 |
| 第二章 天蓝色链霉菌Ffh和FtsY的生物信息学分析 | 第61-88页 |
| ·引言 | 第61-62页 |
| ·材料与方法 | 第62-63页 |
| ·结果 | 第63-83页 |
| ·ftsY基因和FtsY蛋白的序列信息分析 | 第63-73页 |
| ·ftsY,ffh和scRNA在天蓝色链霉菌基因组中的位置 | 第63页 |
| ·ftsY基因启动子 | 第63-64页 |
| ·FtsY的基本理化性质和一级结构分析 | 第64-65页 |
| ·FtsY亲疏水性分析 | 第65-66页 |
| ·FtsY二级结构分析 | 第66-68页 |
| ·FtsY三级空间结构分析 | 第68-69页 |
| ·FtsY的亚细胞定位 | 第69-70页 |
| ·FtsY蛋白的同源性分析 | 第70-72页 |
| ·FtsY蛋白同源进化树构建 | 第72-73页 |
| ·ffh基因和Ffh蛋白的生物信息学分析 | 第73-83页 |
| ·ffh基因启动子分析 | 第73-74页 |
| ·Ffh的理化性质和一级结构分析 | 第74-75页 |
| ·Ffh亲疏水性分析 | 第75-76页 |
| ·Ffh二级结构分析 | 第76-77页 |
| ·Ffh三级空间结构分析 | 第77-78页 |
| ·Ffh的亚细胞定位 | 第78-79页 |
| ·Ffh蛋白的同源性分析 | 第79-82页 |
| ·Ffh蛋白同源进化树构建 | 第82-83页 |
| ·讨论 | 第83-85页 |
| ·本章小结 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-88页 |
| 第三章 FtsY和Ffh的蛋白结构与GTPase活性 | 第88-142页 |
| ·引言 | 第88-89页 |
| ·材料和方法 | 第89-100页 |
| ·材料 | 第89-90页 |
| ·质粒和菌株 | 第89页 |
| ·主要试剂 | 第89页 |
| ·主要仪器 | 第89-90页 |
| ·方法 | 第90-100页 |
| ·天蓝链霉菌基因组提取 | 第90-91页 |
| ·感受态细胞制备 | 第91页 |
| ·细胞转化 | 第91-92页 |
| ·FtsY和Ffh及其功能域的克隆和测序 | 第92-93页 |
| ·重叠延伸法定点突变 | 第93-94页 |
| ·Ffh和FtsYNG结构域的定点突变 | 第94-95页 |
| ·表达载体的构建 | 第95-96页 |
| ·ftsY和ffh及其结构域突变体的表达和鉴定 | 第96页 |
| ·蛋白亲和纯化 | 第96-98页 |
| ·蛋白含量测定 | 第98页 |
| ·GTP水解活性测定 | 第98页 |
| ·K_m和V_(max)测定 | 第98页 |
| ·光亲和交联 | 第98页 |
| ·蛋白酶消化分析 | 第98-99页 |
| ·pH对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响 | 第99页 |
| ·Mg~(2+)对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响 | 第99页 |
| ·温度对对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响 | 第99-100页 |
| ·FtsY-NG和Ffh-NG相互作用模型的建立 | 第100页 |
| ·结果 | 第100-135页 |
| ·FtsY/Ffh蛋白及其功能域克隆、表达和亲和纯化 | 第100-107页 |
| ·FtsY/Ffh蛋白及其功能域克隆 | 第100-103页 |
| ·FtsY/Ffh蛋白及其功能域表达和亲和纯化 | 第103-107页 |
| ·纯化蛋白含量测定 | 第107-108页 |
| ·FtsY/Ffh蛋白及其功能域的GTPase活性 | 第108-110页 |
| ·FtsY蛋白及其功能域的GTPase酶的Km和Vmax | 第110-111页 |
| ·Ffh功能域的GTPase的K_m和V_(max) | 第111-112页 |
| ·FtsY蛋白及其功能域GTPase稳定性 | 第112-114页 |
| ·温度对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响 | 第112-113页 |
| ·pH对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响 | 第113-114页 |
| ·Mg~(2+)对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响 | 第114页 |
| ·Ffh-NG和Ffh-G蛋白功能域GTPase稳定性 | 第114-116页 |
| ·温度对Ffh-NG和Ffh-G GTPase活性影响 | 第114-115页 |
| ·pH对Ffh蛋白功能域GTPase活性影响 | 第115页 |
| ·Mg~(2+)对Ffh功能域GTPase酶活性的影响 | 第115-116页 |
| ·FtsY/Ffh蛋白及其功能域结合GTP的能力 | 第116-117页 |
| ·FtsY和Ffh蛋白及其功能域的蛋白酶消化试验 | 第117-119页 |
| ·Ffh和FtsY蛋白NG结构域中GTP结合位点的分析 | 第119-122页 |
| ·FtsY和Ffh蛋白NG结构域突变位点的确定 | 第122页 |
| ·重叠延伸法介导的突变蛋白的PCR扩增 | 第122-124页 |
| ·FtsY和Ffh NG突变基因片段的TA克隆和DNA测序 | 第124-125页 |
| ·突变基因表达载体构建 | 第125页 |
| ·突变蛋白表达和纯化 | 第125-128页 |
| ·NG蛋白及其突变蛋白GTPase活性测定 | 第128-130页 |
| ·FtsY和Ffh NG突变蛋白的Km和Vmax值 | 第130-131页 |
| ·NG突变蛋白与[λ-~(32)p]GTP体外光亲和交联 | 第131-132页 |
| ·NG突变蛋白的蛋白酶K消化 | 第132-133页 |
| ·天蓝色链霉菌FtsY和Ffh NG蛋白相互作用模型 | 第133-135页 |
| ·讨论 | 第135-137页 |
| ·本章小结 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-142页 |
| 第四章 SRP受体FtsY胞内定位机制 | 第142-173页 |
| ·引言 | 第142-143页 |
| ·材料与方法 | 第143-152页 |
| ·菌株和质粒 | 第143-146页 |
| ·主要试剂 | 第146页 |
| ·主要仪器 | 第146页 |
| ·培养基 | 第146-147页 |
| ·绿色荧光蛋白标记融合蛋白的PCR扩增和重组载体构建 | 第147-148页 |
| ·枯草芽孢杆菌168感受态制备和转化 | 第148-149页 |
| ·淀粉酶缺陷型筛选阳性克隆 | 第149页 |
| ·重组菌株的诱导表达和SDS-PAGE分析 | 第149页 |
| ·激光共聚焦荧光显微观察 | 第149页 |
| ·蛋白质印迹 | 第149-151页 |
| ·微流控分析芯片的荧光检测 | 第151-152页 |
| ·结果 | 第152-170页 |
| ·E.coli FtsY,S.coelicolor FtsY,B.subtilis FtsY及其功能域PCR | 第152-153页 |
| ·重组整合pFG质粒载体酶切鉴定 | 第153-154页 |
| ·利用淀粉酶缺失性状筛选阳性克隆 | 第154-156页 |
| ·外源整合蛋白的诱导表达和蛋白质印迹 | 第156-158页 |
| ·外源蛋白表达对宿主枯草芽孢杆菌生长的抑制作用 | 第158-160页 |
| ·E.coli FtsY的胞内定位 | 第160-161页 |
| ·S.coelicolor FtsY的胞内定位 | 第161-162页 |
| ·E.coli FtsY-NG的胞内定位 | 第162-163页 |
| ·S.coelicolor FtsY-NG的胞内定位 | 第163-164页 |
| ·E.coli FtsY-A与S.coelicolor FtsY-NG融合蛋白的胞内定位 | 第164-165页 |
| ·E.coli FtsY-NG与S.coelicolor FtsY-N融合蛋白的胞内定位 | 第165-166页 |
| ·B.subtilis FtsY-NG的胞内定位 | 第166-167页 |
| ·B.subtilis FtsY-NG与S.coelicolor FtsY-N融合蛋白的胞内定位 | 第167页 |
| ·B.subtilis FtsY-N与S.coelicolor FtsY-NG融合蛋白的胞内定位 | 第167-168页 |
| ·GFP蛋白的定位 | 第168-169页 |
| ·细胞定位的统计分析 | 第169-170页 |
| ·讨论 | 第170-171页 |
| ·本章小结 | 第171页 |
| 参考文献 | 第171-173页 |
| 第五章 S.coelicolor FtsY和Ffh及其NG结构域对Ecoli突变株的补偿 | 第173-197页 |
| ·引言 | 第173-175页 |
| ·材料和方法 | 第175-180页 |
| ·材料 | 第175-176页 |
| ·菌株和质粒 | 第175页 |
| ·主要试剂 | 第175-176页 |
| ·培养基 | 第176页 |
| ·方法 | 第176-180页 |
| ·PCR片段的制备 | 第176-177页 |
| ·PCR片段的电转化 | 第177页 |
| ·大肠杆菌基因组提取 | 第177-178页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第178页 |
| ·质粒pKD46的消除 | 第178页 |
| ·E.coli生长曲线测定 | 第178-179页 |
| ·E.coli细胞形态的透射电子显微镜分析 | 第179页 |
| ·E.coli细胞膜蛋白的SDS-PAGE | 第179-180页 |
| ·ffh和ftsY基因及其NG结构域补偿载体的构建 | 第180页 |
| ·补偿载体的转化和诱导表达 | 第180页 |
| ·结果 | 第180-191页 |
| ·基因敲除PCR片段的制备 | 第180-181页 |
| ·电转化法构建突变株 | 第181页 |
| ·E.coli ffh和ftsY基因阻断突变株PCR鉴定 | 第181-182页 |
| ·E.coli ffh和ftsY基因阻断突变株的测序鉴定 | 第182-184页 |
| ·S.coelicolor FtsY和Ffh及其功能域补偿载体构建和SDS-PAGE | 第184-186页 |
| ·阻断突变株和补偿后突变株生长曲线比较 | 第186-187页 |
| ·大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后细胞形态的变化 | 第187-188页 |
| ·温度对大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后菌株生长的影响 | 第188-189页 |
| ·大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后膜蛋白SDS-PAGE分析 | 第189-190页 |
| ·大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后细胞微结构 | 第190-191页 |
| ·讨论 | 第191-193页 |
| ·本章小结 | 第193-194页 |
| 参考文献 | 第194-197页 |
| 第六章 SRP受体FtsY蛋白对链霉菌形态分化和代谢的调控 | 第197-233页 |
| ·引言 | 第197-198页 |
| ·材料和方法 | 第198-211页 |
| ·菌种和载体 | 第198-199页 |
| ·主要试剂 | 第199-200页 |
| ·主要仪器 | 第200页 |
| ·主要培养基 | 第200-201页 |
| ·方法 | 第201-211页 |
| ·摇瓶培养 | 第201页 |
| ·抗生素发酵 | 第201页 |
| ·S.coelicolor孢子悬液制备 | 第201页 |
| ·S.coelicolor原生质体制备 | 第201-202页 |
| ·S.coelicolor基因组DNA的提取 | 第202页 |
| ·链霉菌质粒DNA的提取 | 第202-203页 |
| ·S.coelicolor的转化和再生 | 第203页 |
| ·天蓝色链霉菌生物量测定 | 第203页 |
| ·抗生素放线菌紫素(Actinorhodin)的测定 | 第203-204页 |
| ·十一烷基灵菌红素(Undecylprodigiosin)的测定 | 第204页 |
| ·基因敲除和突变株筛选 | 第204-205页 |
| ·用于基因功能互补的质粒构建 | 第205页 |
| ·Southern杂交 | 第205-207页 |
| ·扫描电镜样品制备 | 第207-208页 |
| ·甜菜碱测定 | 第208页 |
| ·S.coelicolor RNA提取 | 第208-209页 |
| ·RNA甲醛变性电泳 | 第209-210页 |
| ·Northern杂交 | 第210-211页 |
| ·DNA双链探针的制备 | 第211页 |
| ·结果 | 第211-227页 |
| ·天蓝色链霉菌ffh和ftsY基因阻断载体构建 | 第211-212页 |
| ·天蓝色链霉菌ffh和ftsY阻断突变株的筛选及PCR鉴定 | 第212-213页 |
| ·ffh和ftsY基因破坏的Southern杂交验证 | 第213-215页 |
| ·ffh和ftsY基因互补载体的构建 | 第215-216页 |
| ·ffh和ftsY基因及其功能域互补突变株的筛选和PCR鉴定 | 第216-217页 |
| ·ffh和ftsY破坏子及互补菌株的形态变化 | 第217-220页 |
| ·ffh和ftsY阻断突变株及回补菌株的生长曲线和抗生素产量变化 | 第220-224页 |
| ·ffh阻断突变株及其互补菌株的生长曲线和抗生素产量 | 第220-222页 |
| ·ftsY阻断突变株及其互补菌株的生长曲线和抗生素产量测定 | 第222-224页 |
| ·S.coelicolor M145,ft2,ft2C1和ft2C2胞内甜菜碱含量 | 第224-225页 |
| ·探针标记所需模板的PCR制备 | 第225-226页 |
| ·prox,whiG,whiB和whiH基因的转录分析 | 第226-227页 |
| ·讨论 | 第227-229页 |
| ·本章小结 | 第229-230页 |
| 参考文献 | 第230-233页 |
| 结论与展望 | 第233-238页 |
| 缩略表 | 第238-239页 |
| 附录测序报告 | 第239-266页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及成果 | 第266-267页 |
| 致谢 | 第267页 |
