| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-13页 |
| 符号与缩略语说明 | 第13-15页 |
| 前言 | 第15-19页 |
| 参考文献 | 第17-19页 |
| 第一章 分支杆菌可诱导表达系统的建立及应用 | 第19-43页 |
| 1 材料和方法 | 第20-29页 |
| ·菌株、质粒及培养基 | 第20页 |
| ·酶、抗生素和化学试剂 | 第20-21页 |
| ·大肠杆菌普通感受态细胞的制备及转化 | 第21页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第21页 |
| ·质粒DNA的小量酶切 | 第21-22页 |
| ·目的基因片段与载体的连接 | 第22页 |
| ·重组克隆的鉴定 | 第22页 |
| ·分支杆菌基因组DNA的提取 | 第22-23页 |
| ·M.smegmatis乙酰胺酶基因启动子pACE的扩增 | 第23页 |
| ·分支杆菌可诱导表达载体的构建 | 第23-25页 |
| ·结核杆菌嵌合抗原Ag856A2在M.smegmatis中的表达与纯化 | 第25-28页 |
| ·结核杆菌嵌合抗原在M.bois BCG中的表达与鉴定 | 第28-29页 |
| 2 结果与分析 | 第29-36页 |
| ·分支杆菌可诱导性启动子pACE的扩增、克隆及鉴定 | 第29-31页 |
| ·分支杆菌可诱导表达载体pMF系列构建及鉴定 | 第31页 |
| ·M.smegmatis生长曲线 | 第31-32页 |
| ·结核杆菌嵌合基因的扩增与克隆 | 第32-33页 |
| ·结核杆菌嵌合抗原Ag856A2在M.smegmatis的表达及鉴定 | 第33-34页 |
| ·结核杆菌嵌合抗原Ag856A2在M.smegmatis的大量表达及纯化 | 第34页 |
| ·可诱导表达载体pMF系列在M.bovis BCG中不受乙酰胺调控 | 第34-36页 |
| 3 讨论 | 第36-38页 |
| 4 本章小结 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-43页 |
| 第二章 分支杆菌差异表达载体的建立及其应用 | 第43-69页 |
| 1 材料和方法 | 第43-51页 |
| ·菌株、质粒及培养基 | 第43-44页 |
| ·酶和引物 | 第44-45页 |
| ·E.coli lacZ基因截短片段的扩增 | 第45页 |
| ·分支杆菌启动子探针载体pMC210的构建 | 第45-46页 |
| ·pfurA基因定点突变及其亚克隆 | 第46-47页 |
| ·分支杆菌感受态细胞的制备及电转化 | 第47页 |
| ·体外β-半乳糖苷酶活性分析 | 第47页 |
| ·鼠巨噬细胞RAW264.7细胞培养与分支杆菌感染 | 第47页 |
| ·细胞内β-半乳糖苷酶活性分析 | 第47-48页 |
| ·rBCG::lacZ疫苗制备与小鼠免疫 | 第48页 |
| ·ELISA测定血清抗体效价 | 第48-49页 |
| ·抗体分型 | 第49页 |
| ·小鼠脾脏分离及淋巴细胞制备 | 第49页 |
| ·IFN-γ ELISPOT | 第49-50页 |
| ·统计分析 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-59页 |
| ·lacZ'基因的扩增及分支杆菌启动子探针载体pMC210的构建 | 第51-52页 |
| ·pfurA基因定点突变及其亚克隆 | 第52-54页 |
| ·体外β-半乳糖苷酶活性分析 | 第54页 |
| ·细胞内β-半乳糖苷酶活性分析 | 第54-55页 |
| ·rBCG::lacZ诱导的体液免疫应答分析 | 第55-57页 |
| ·rBCG::lacZ诱导的细胞免疫应答分析 | 第57-59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| 4 本章小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 第三章 结核杆菌嵌合基因重组卡介苗的免疫原性研究 | 第69-97页 |
| 1 材料和方法 | 第69-76页 |
| ·菌株、质粒及培养基 | 第69-70页 |
| ·酶和引物 | 第70页 |
| ·M.tb主要保护性抗原Ag85A在E.coli中的克隆、表达与纯化 | 第70-72页 |
| ·M.tb早期分泌蛋白ESAT-6在E.coli中的克隆、表达与纯化 | 第72页 |
| ·M.tb嵌合抗原Ag856A2在E.coli.中的克隆、表达与纯化 | 第72-73页 |
| ·Ag85A、ESAT-6单克隆抗体的制备 | 第73页 |
| ·分支杆菌差异表达载体的构建 | 第73页 |
| ·M.tb嵌合基因重组卡介苗(rBCG856A2)的构建 | 第73-74页 |
| ·Western-blot鉴定嵌合抗原在M.bois BCG中的表达 | 第74-75页 |
| ·rBCG856A2疫苗制备与小鼠免疫 | 第75页 |
| ·ELISA测定血清抗体水平及抗体亚类 | 第75页 |
| ·小鼠脾淋巴细胞制备及IFN_(-γ) ELISPOT测定 | 第75页 |
| ·统计分析 | 第75-76页 |
| 2.结果与分析 | 第76-87页 |
| ·M.tb主要保护性抗原Ag85A在E.coli中的表达与纯化 | 第76-77页 |
| ·M.tb早期分泌抗原ESAT-6在E.coli中的表达与纯化 | 第77-78页 |
| ·M.tb嵌合抗原Ag856A2在E.coli中的表达与纯化 | 第78-79页 |
| ·Ag85A、ESAT-6小鼠单克隆抗体的制备 | 第79页 |
| ·分支杆菌差异表达载体pMFA系列的构建 | 第79-80页 |
| ·嵌合基因重组卡介苗(rBCG856A2)菌株的筛选及其鉴定 | 第80-82页 |
| ·rBCG856A2诱导的体液免疫应答分析 | 第82-85页 |
| ·rBCG856A2诱导的细胞免疫应答分析 | 第85-87页 |
| 3 讨论 | 第87-90页 |
| 4 本章小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
| 第四章 全文总结 | 第97-101页 |
| 1 全文研究内容总结、讨论与展望 | 第97-99页 |
| 2 本论文的主要创新点 | 第99-101页 |
| 第五章 文献综述 | 第101-139页 |
| 1 结核分支杆菌及结核病的流行病学 | 第101-104页 |
| ·结核分支杆菌的生物学性状 | 第101-102页 |
| ·结核杆菌的感染、潜伏及其复燃 | 第102-103页 |
| ·结核病的流行病学 | 第103-104页 |
| 2 抗结核杆菌感染的免疫机理 | 第104-109页 |
| ·结核杆菌感染宿主的生物学过程 | 第105页 |
| ·巨噬细胞与天然免疫反应 | 第105-106页 |
| ·T淋巴细胞与细胞免疫反应 | 第106-108页 |
| ·细胞因子和免疫保护之间的关系 | 第108-109页 |
| 3 卡介苗的研制历史、保护效果及其失效原因分析 | 第109-112页 |
| ·卡介苗的研制与使用 | 第109页 |
| ·卡介苗的临床试验及其保护效果 | 第109-111页 |
| ·卡介苗失效原因分析 | 第111-112页 |
| 4 基于卡介苗效力不足,探索结核病新型疫苗研制的优化策略 | 第112-118页 |
| ·卡介苗缺乏重要保护性抗原——运用基因组学开发合理的疫苗 | 第112-113页 |
| ·加强T细胞亚类的最适组合——靶向CD8~+T细胞亚类 | 第113-114页 |
| ·环境分支杆菌与BCG相互作用——克服环境分支杆菌致敏影响的疫苗设计 | 第114-115页 |
| ·防止BCG效力减弱——加强免疫的作用 | 第115-116页 |
| ·基于卡介苗效力不足,探索结核病新型疫苗研制的优化策略 | 第116-118页 |
| 5 预防性结核病新疫苗的研究方向及其进展 | 第118-122页 |
| ·取代卡介苗的初种疫苗(Priming Vaccines) | 第119-120页 |
| ·增强BCG免疫效果的加强疫苗(Late Booster Vaccines) | 第120-122页 |
| ·用于潜伏感染者的多相疫苗(Post-exposure Multiphase Vaccines) | 第122页 |
| 6 结核病新疫苗的临床试验及WHO控制和消灭结核病的全球计划 | 第122-127页 |
| ·进入临床试验阶段的结核病新疫苗 | 第123-125页 |
| ·结核病新疫苗临床试验面临的主要问题 | 第125-126页 |
| ·WHO控制和消灭结核病的全球计划(Global Plan to Stop TB) | 第126-127页 |
| 7 结语与展望 | 第127页 |
| 参考文献 | 第127-139页 |
| 附录 | 第139-163页 |
| 附录1 实验室常规培养基及分子生物学试剂 | 第139-140页 |
| 附录2 常规免疫学检测用试剂 | 第140-141页 |
| 附录3 分支杆菌培养基及其电转感受态细胞制备用试剂及仪器 | 第141页 |
| 附录4 β-半乳糖苷酶活测定所需仪器及试剂 | 第141-142页 |
| 附录5 相关分支杆菌穿梭表达载体序列 | 第142-163页 |
| 攻读博士学位期间专利申请及学术论文发表情况 | 第163-165页 |
| 致谢 | 第165-166页 |
