| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-49页 |
| 一、扇贝养殖业的发展及面临问题 | 第12-16页 |
| 1. 扇贝养殖初期的蓬勃发展 | 第12页 |
| 2. 扇贝养殖中出现的问题 | 第12-15页 |
| 3. 扇贝养殖业的可持续发展 | 第15-16页 |
| 二、无脊椎动物固有免疫系统 | 第16-37页 |
| 1. 免疫系统概述 | 第16-18页 |
| 2. 固有免疫系统 | 第18-37页 |
| ·免疫识别 | 第18-20页 |
| ·病原相关分子模式 | 第19页 |
| ·模式识别受体 | 第19-20页 |
| ·免疫信号的调整放大和信号传导 | 第20-26页 |
| ·丝氨酸蛋白酶级联反应 | 第20-24页 |
| ·免疫信号转导的途径 | 第24-26页 |
| ·病源体清除 | 第26-37页 |
| ·细胞免疫 | 第28-30页 |
| ·体液免疫 | 第30-37页 |
| 三、丝氨酸蛋白酶抑制剂研究 | 第37-47页 |
| 1. 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类 | 第38-43页 |
| ·Kazal 家族 | 第38-40页 |
| ·Kunitz 家族 | 第40-41页 |
| ·Serpin 家族 | 第41-42页 |
| ·α-巨球蛋白 | 第42-43页 |
| 2. 丝氨酸蛋白酶抑制剂参与免疫过程及其作用 | 第43-47页 |
| ·调节内源蛋白 | 第44页 |
| ·参与 Toll 信号通路的激活 | 第44-45页 |
| ·参与调节前酚氧化物酶激活过程 | 第45-46页 |
| ·参与血淋巴凝结 | 第46页 |
| ·防止病原体蛋白酶的入侵 | 第46-47页 |
| 四、本研究的目的与意义 | 第47-49页 |
| 第二章 材料与方法 | 第49-68页 |
| 一、实验材料 | 第49-51页 |
| 1. 构建cDNA 文库的扇贝样品及其处理 | 第49页 |
| 2. 菌刺激扇贝样品及其处理 | 第49页 |
| 3. 主要化学试剂及仪器设备 | 第49-51页 |
| ·主要化学试剂 | 第49-50页 |
| ·培养基和试剂的配置 | 第50-51页 |
| ·主要仪器设备 | 第51页 |
| 二、实验方法 | 第51-68页 |
| 1. 扇贝总 RNA 的提取 | 第51-53页 |
| ·实验用品的预处理 | 第51-52页 |
| ·RNA 提取过程 | 第52-53页 |
| 2.c DNA 文库的构建与序列分析 | 第53页 |
| ·cDNA 文库的构建 | 第53页 |
| ·序列分析与目的基因片段的获得 | 第53页 |
| 3.R ACE 扩增获得cDNA 序列的5’及3’端 | 第53-56页 |
| ·扇贝cDNA 模板第一链的合成 | 第53-54页 |
| ·3' RACE 扩增 | 第54-55页 |
| ·5' RACE 扩增 | 第55-56页 |
| 4. 琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物 | 第56-57页 |
| 5. 感受态细胞的制备、连接和转化 | 第57-58页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第57页 |
| ·连接反应 | 第57-58页 |
| ·转化 | 第58页 |
| 6. 质粒的提取 | 第58页 |
| 7. 目的基因的生物信息学分析 | 第58-59页 |
| 8. Real time RT-PCR 检测目的基因在组织及菌刺激后的的表达 | 第59-62页 |
| ·荧光实时定量PCR 的原理 | 第59-60页 |
| ·real time PCR 的引物设计 | 第60页 |
| ·高效率扩增的条件的确立 | 第60页 |
| ·体外刺激实验和目的基因的表达检测 | 第60-62页 |
| 9. 蛋白的原核重组表达 | 第62-65页 |
| ·重组质粒构建 | 第62-63页 |
| ·重组蛋白的表达与检测 | 第63页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| ·重组蛋白的复性 | 第64-65页 |
| ·重组蛋白的浓度测定 | 第65页 |
| 10. 重组蛋白的抑制蛋白酶活性检测及动力学分析 | 第65-67页 |
| 11. 重组蛋白的抑菌活性 | 第67-68页 |
| 第三章 实验结果 | 第68-93页 |
| 一、栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 的克隆，重组表达与活性 | 第68-81页 |
| 1. 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 全长cDNA 的获得 | 第68页 |
| 2. 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 结构与同源性 | 第68-74页 |
| ·丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI 结构 | 第68-72页 |
| ·栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI 的同源性 | 第72-74页 |
| 3. 栉孔扇贝CfKZSPI 基因的时序表达 | 第74-76页 |
| 4. CfKZSPI 基因单结构域的原核重组表达 | 第76-80页 |
| ·CfKZSPI-12 Kazal 结构域的原核重组子构建 | 第76-78页 |
| ·CfKZSPI-12 Kazal 结构域的原核重组表达与纯化 | 第78-80页 |
| 5. rCfKZSPI-12 抑制蛋白酶活性 | 第80-81页 |
| 6. rCfKZSPI-12 抑制常数的获得 | 第81页 |
| 二、海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Aikunitz 的克隆、重组表达与活性 | 第81-93页 |
| 1. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Aikunitz 的获得 | 第81-84页 |
| 2. 海湾扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Aikunitz 的序列与同源性 | 第84-86页 |
| 3. 海湾扇贝Aikunitz 基因的组织表达 | 第86-87页 |
| 4. 海湾扇贝Aikunitz 基因在菌刺激后的表达规律 | 第87-89页 |
| 5. Aikunitz 基因的原核重组表达 | 第89-91页 |
| ·Aikunitz 原核重组子构建 | 第89-90页 |
| ·Aikunitz 原核重组表达与纯化 | 第90-91页 |
| 6. rAikunitz 蛋白的活性检测 | 第91-93页 |
| ·rAikunitz 蛋白的抑制蛋白酶活性检测 | 第91页 |
| ·琼脂扩散法检测rAikunitz 的抗菌活性 | 第91-93页 |
| 第四章 讨论 | 第93-100页 |
| 1. CfKZSPI 的克隆、重组表达与活性 | 第93-97页 |
| 2. Aikunitz 的克隆、重组表达与活性 | 第97-100页 |
| 第五章 结论 | 第100-102页 |
| 参考文献 | 第102-117页 |
| 博士期间发表和完成的论文 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118页 |
