| 目录 | 第1-10页 |
| 英文缩略语 | 第10-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| ABSTRACT | 第15-17页 |
| 前言 | 第17-19页 |
| 第一部分 PLK1、AURORAA和AURORAC的表达及纯化 | 第19-71页 |
| 1.实验材料 | 第19-25页 |
| ·菌种 | 第19页 |
| ·细胞株 | 第19页 |
| ·质粒 | 第19-20页 |
| ·培养基 | 第20页 |
| ·E coli培养基 | 第20页 |
| ·Hela培养基 | 第20页 |
| ·工具酶 | 第20页 |
| ·抗生素 | 第20-21页 |
| ·常用试剂盒 | 第21页 |
| ·常用试剂 | 第21-24页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第21页 |
| ·SDS-PAGE试剂 | 第21-22页 |
| ·细胞消化传代使用液 | 第22页 |
| ·Western Blot试剂 | 第22-23页 |
| ·蛋白纯化相关溶液 | 第23页 |
| ·激酶活性检测相关溶液 | 第23页 |
| ·其他试剂 | 第23-24页 |
| ·主要实验仪器 | 第24-25页 |
| 2.实验方法 | 第25-46页 |
| ·人Hela细胞复苏 | 第25页 |
| ·人Hela细胞传代培养 | 第25页 |
| ·人Hela细胞冻存 | 第25-26页 |
| ·人Hela细胞总RNA的提取(Trizol) | 第26-27页 |
| ·用Trizol试剂(Invitrogen)进行细胞总RNA的提取 | 第26页 |
| ·总RNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第26页 |
| ·RNA浓度测定 | 第26-27页 |
| ·RT-PCR(Invitrogen) | 第27页 |
| ·引物设计 | 第27-28页 |
| ·最适PCR温度的摸索 | 第28-29页 |
| ·PCR产物琼脂糖凝胶电泳,切胶回收 | 第29-30页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第29页 |
| ·PCR产物的纯化回收(PCR产物纯化试剂盒) | 第29页 |
| ·DNA浓度及纯度检测 | 第29-30页 |
| ·PCR产物末端加A反应 | 第30页 |
| ·重组克隆质粒的构建及验证 | 第30-33页 |
| ·PCR产物与克隆载体pMD-18T(Takara)载体连接 | 第30页 |
| ·E.coli DH5α/BL21感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| ·重组克隆质粒转化E.coliDH5α感受态细胞 | 第31页 |
| ·重组克隆质粒的验证 | 第31-33页 |
| ·重组表达质粒的构建及验证 | 第33-35页 |
| ·表达载体和重组克隆质粒分别双酶切 | 第33-34页 |
| ·回收凝胶中的DNA片段(DNA纯化回收试剂盒) | 第34页 |
| ·基因片断和表达载体的连接 | 第34页 |
| ·基因片断和表达载体连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞 | 第34-35页 |
| ·基因与表达载体连接产物检测 | 第35页 |
| ·蛋白的诱导表达 | 第35-37页 |
| ·重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3溶原菌) | 第35-36页 |
| ·宿主菌的保存 | 第36页 |
| ·接种冻存培养菌 | 第36页 |
| ·诱导培养物的光密度分析 | 第36页 |
| ·含有重组表达质粒的E.coli BL21的生长 | 第36页 |
| ·含有重组表达质粒的E.coli BL21的诱导 | 第36-37页 |
| ·含有重组表达质粒的E.coli BL2的诱导优化 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE | 第37-40页 |
| ·对照组样品处理 | 第37-38页 |
| ·IPTG诱导组样品处理 | 第38页 |
| ·制胶、上样和电泳 | 第38-40页 |
| ·Western-blot分析 | 第40页 |
| ·纯化蛋白 | 第40-43页 |
| ·柱的预处理(column preparation) | 第41-42页 |
| ·样品的预处理(sample preparation) | 第42页 |
| ·使用(A|¨)KTA prime系统纯化蛋白 | 第42-43页 |
| ·收集含有目的蛋白的洗脱液,蒸馏水进行透析,然后冷冻干燥保存 | 第43页 |
| ·纯化蛋白定量 | 第43页 |
| ·纯化蛋白酶活测定 | 第43-44页 |
| ·抑制剂筛选体系的建立 | 第44-46页 |
| ·系统优化 | 第44-46页 |
| 3.结果和分析 | 第46-67页 |
| ·重组表达质粒构建流程图 | 第46页 |
| ·人Hela细胞总RNA的提取及浓度测定 | 第46-47页 |
| ·Aurora A、Aurora C和PLK1基因片段的克隆 | 第47页 |
| ·重组克隆质粒的构建及验证 | 第47-58页 |
| ·PCR验证 | 第47-48页 |
| ·双酶切验证 | 第48页 |
| ·测序验证 | 第48-58页 |
| ·表达质粒的构建和验证 | 第58-64页 |
| ·PCR验证 | 第58-59页 |
| ·双酶切验证 | 第59页 |
| ·测序验证 | 第59-64页 |
| ·SDS-PAGE分析蛋白诱导表达结果 | 第64-65页 |
| ·全蛋白SDS-PAGE | 第64页 |
| ·诱导蛋白的可溶性分析 | 第64-65页 |
| ·Western-blot结果 | 第65页 |
| ·表达蛋白的纯度分析 | 第65-66页 |
| ·纯化蛋白的浓度测定 | 第66-67页 |
| 4.讨论 | 第67-70页 |
| 5.结论 | 第70-71页 |
| 第二部分 PLK1激酶抑制剂的筛选和活性验证 | 第71-103页 |
| 1.实验材料 | 第71-75页 |
| ·菌株 | 第71页 |
| ·细胞株 | 第71页 |
| ·培养基 | 第71-72页 |
| ·试剂盒 | 第72页 |
| ·抗体 | 第72页 |
| ·试剂 | 第72-74页 |
| ·激酶活性分析试剂 | 第72-73页 |
| ·细胞消化传代使用液 | 第73页 |
| ·细胞周期及凋亡检测试剂 | 第73页 |
| ·细胞增殖抑制实验试剂 | 第73-74页 |
| ·检测Cyclin B1蛋白含量试剂 | 第74页 |
| ·其他主要材料 | 第74页 |
| ·主要仪器设备 | 第74页 |
| ·分子对接 | 第74-75页 |
| 2.实验方法 | 第75-83页 |
| ·PLK1抑制剂的筛选 | 第75-76页 |
| ·酵母CDC5和人类PLK1保守区域序列比对 | 第75页 |
| ·筛选模型 | 第75页 |
| ·化合物的稀释 | 第75页 |
| ·筛选方法 | 第75-76页 |
| ·筛选结果判断 | 第76页 |
| ·MIC的确定 | 第76-77页 |
| ·初筛阳性化合物对PLK1抑制作用的生化分析方法 | 第77-78页 |
| ·利用生化分析方法测定阳性化合物对PLK1作用 | 第77页 |
| ·阳性化合物对PLK1激酶活性抑制方式的探讨 | 第77-78页 |
| ·MTT法检测阳性化合物及其衍生物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 | 第78页 |
| ·阳性化合物及其衍生物对A549细胞增殖的抑制作用 | 第78页 |
| ·阳性化合物对BEL-7402和HepG2细胞的增殖抑制作用 | 第78页 |
| ·流式细胞仪检测阳性化合物对肿瘤细胞周期的影响 | 第78-79页 |
| ·染色法检测细胞凋亡 | 第79-80页 |
| ·Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 | 第79页 |
| ·Hochest 33342染色检测细胞凋亡 | 第79-80页 |
| ·流式细胞仪检测Cyclin B1蛋白含量 | 第80页 |
| ·阳性化合物与PLK1活性位点对接 | 第80-83页 |
| ·蛋白结构调出 | 第80页 |
| ·蛋白3D模型优化 | 第80-81页 |
| ·确定活性位点 | 第81-82页 |
| ·阳性化合物与PLK1活性位点对接 | 第82-83页 |
| 3.实验结果 | 第83-98页 |
| ·酵母CDC5与人类PLK1激酶保守区域序列比对 | 第83页 |
| ·酵母模型筛选结果 | 第83-84页 |
| ·阳性化合物DH166 MIC的测定 | 第84页 |
| ·阳性化合物DH166抑制纯化的重组PLK1激酶 | 第84-86页 |
| ·阳性化合物DH166抑制体外纯化的PLK1的激酶活性 | 第84-85页 |
| ·阳性化合物DH166竞争性抑制纯化的PLK1激酶的活性 | 第85-86页 |
| ·阳性化合物DH166抑制肿瘤细胞的增殖 | 第86-87页 |
| ·阳性化合物DH166影响肿瘤细胞的细胞周期 | 第87-89页 |
| ·阳性化合物DH166能诱导酵母细胞的周期阻滞 | 第89-90页 |
| ·阳性化合物DH166能诱导A549细胞凋亡 | 第90-92页 |
| ·Annexin V-FITC/PI双染法检测 | 第90-91页 |
| ·Hochest 33342染色法检测 | 第91-92页 |
| ·DH166导致A549细胞内Cyclin B1的积累 | 第92-94页 |
| ·阳性化合物DH166与PLK1的分子对接 | 第94-96页 |
| ·PLK1 3D结构的获取和活性位点分析 | 第94-95页 |
| ·阳性化合物DH166与PLK1活性位点对接结果 | 第95-96页 |
| ·阳性化合物DH166同系物对A549及酵母细胞的增殖具抑制作用 | 第96-98页 |
| 4.讨论 | 第98-102页 |
| ·模式生物-酵母 | 第98-99页 |
| ·蛋白激酶在抗癌药物研究中的应用 | 第99-100页 |
| ·β-咔啉碱类化合物的抗肿瘤研究 | 第100-101页 |
| ·多元药理学 | 第101-102页 |
| 5.结论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-109页 |
| 综述一 保罗样激酶1(PLK1)研究进展 | 第109-129页 |
| 1.染色体上的定位 | 第110页 |
| 2.蛋白结构特点 | 第110-111页 |
| ·催化结构域 | 第110页 |
| ·PBD结构域 | 第110-111页 |
| 3.蛋白表达量的变化及调节 | 第111-113页 |
| ·转录水平上的调控 | 第111-112页 |
| ·翻译后修饰 | 第112页 |
| ·泛素-蛋白酶体通路降解 | 第112页 |
| ·蛋白之间的相互作用 | 第112-113页 |
| 4.功能总述 | 第113-117页 |
| ·G2/M期转化 | 第113-114页 |
| ·DNA损伤检验点及检验点造成的阻滞后细胞周期的再启动 | 第114-115页 |
| ·参与中心体成熟以及纺锤丝形成过程 | 第115-116页 |
| ·高尔基体的解体 | 第116页 |
| ·姐妹染色单体的分离 | 第116页 |
| ·胞质分裂和有丝分裂的退出 | 第116-117页 |
| 5.与癌症的关系 | 第117-118页 |
| 6.以PLK1为靶点的治疗方法 | 第118-122页 |
| ·基因操作 | 第118-119页 |
| ·反义寡核苷酸(ASO) | 第118页 |
| ·小RNA干扰(siRNA) | 第118-119页 |
| ·抗体注射技术 | 第119页 |
| ·显性抑制技术 | 第119页 |
| ·小分子抑制剂 | 第119-122页 |
| ·ATP竞争型抑制剂 | 第120-121页 |
| ·非ATP竞争型抑制剂 | 第121-122页 |
| 7.结语 | 第122-123页 |
| 参考文献 | 第123-129页 |
| 综述二 极光激酶A、C研究进展 | 第129-158页 |
| 1.家族成员 | 第129-130页 |
| 2.基因概述 | 第130页 |
| 3.蛋白结构 | 第130-131页 |
| 4.定位 | 第131页 |
| 5.激酶活性的调节 | 第131-134页 |
| ·Aurora A转录水平的调节 | 第132页 |
| ·激活 | 第132页 |
| ·Ajuba介导的Aurora A活化 | 第132页 |
| ·TPX2介导的Aurora A活化 | 第132页 |
| ·I-2介导的Aurora A活化 | 第132页 |
| ·抑制 | 第132-133页 |
| ·降解 | 第133-134页 |
| ·APC/C-CDH1介导的降解 | 第133页 |
| ·AIP介导的降解 | 第133-134页 |
| 6.功能 | 第134-137页 |
| ·Aurora A的功能(图4) | 第134-136页 |
| ·G2/M期转换 | 第134页 |
| ·中心体成熟和分离 | 第134-135页 |
| ·双极纺锤体的组装 | 第135页 |
| ·胞质分裂 | 第135-136页 |
| ·抑癌基因p53 | 第136页 |
| ·端粒酶活性 | 第136页 |
| ·Aurora C的功能 | 第136-137页 |
| 7.与癌症的关系 | 第137-138页 |
| 8.以AURORAA为靶点的抗肿瘤药物 | 第138-144页 |
| ·Azaindoles | 第139页 |
| ·MLN8054 | 第139页 |
| ·咪唑并吡啶类 | 第139-140页 |
| ·五元杂环并吡唑类 | 第140-141页 |
| ·单嘧啶环类 | 第141页 |
| ·嘧啶氨基喹啉类 | 第141-142页 |
| ·喹唑啉类 | 第142页 |
| ·苯氨基喹唑啉类 | 第142页 |
| ·嘧啶和吡啶氨基喹唑啉类 | 第142-144页 |
| ·五元杂环氨基喹唑啉类 | 第144页 |
| 9.结语 | 第144-145页 |
| 参考文献 | 第145-158页 |
| 致谢 | 第158页 |
