| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-46页 |
| 1.1 生物体中的5-羟甲基胞嘧啶 | 第16-23页 |
| 1.1.1 5-羟甲基胞嘧啶的简介 | 第16-19页 |
| 1.1.2 生物体中5-羟甲基胞嘧啶的合成方式 | 第19-23页 |
| 1.2 米多霉素的研究背景与进展 | 第23-38页 |
| 1.2.1 米多霉素的发现和应用 | 第24-27页 |
| 1.2.2 米多霉素衍生物 | 第27-29页 |
| 1.2.3 米多霉素的生物合成研究进展 | 第29-38页 |
| 1.3 胞苷酸羟甲基化酶MilA和羟甲基胞苷酸N-糖苷酶MilB | 第38-41页 |
| 1.3.1 胞苷酸羟甲基化酶MilA及其核糖底物特异性 | 第38-40页 |
| 1.3.2 羟甲基胞苷酸N-糖苷酶MilB及其底物特异性 | 第40-41页 |
| 1.4 蛋白质的结构生物学简介 | 第41-45页 |
| 1.4.1 蛋白质的各级结构 | 第41-43页 |
| 1.4.2 蛋白质的X射线晶体学 | 第43-45页 |
| 1.5 本课题研究意义 | 第45-46页 |
| 第二章 材料与方法 | 第46-65页 |
| 2.1 菌株,质粒,引物和仪器 | 第46-49页 |
| 2.1.1 菌株 | 第46页 |
| 2.1.2 质粒 | 第46-47页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第47-48页 |
| 2.1.4 主要仪器及型号 | 第48-49页 |
| 2.2 实验材料 | 第49-54页 |
| 2.2.1 培养基和实验试剂 | 第49-54页 |
| 2.3 实验方法 | 第54-65页 |
| 2.3.1 菌种培养及保存 | 第54页 |
| 2.3.2 大肠杆菌质粒的小量提取 | 第54页 |
| 2.3.3 聚合酶链式反应(PCR) | 第54-55页 |
| 2.3.4 DNA的沉淀,酶切,回收以及连接 | 第55页 |
| 2.3.5 大肠杆菌钙转感受态细胞制备 | 第55-56页 |
| 2.3.6 大肠杆菌钙转感受态细胞的转化 | 第56页 |
| 2.3.7 蛋白表达及纯化 | 第56-57页 |
| 2.3.8 硒代蛋白的制备 | 第57-58页 |
| 2.3.9 蛋白结晶筛选及优化 | 第58-60页 |
| 2.3.10 X射线晶体衍射数据收集和处理 | 第60页 |
| 2.3.11 结构解析和精细修正 | 第60-61页 |
| 2.3.12 基因定点突变 | 第61页 |
| 2.3.13 5mCMP、5mdCMP和hmCMP的制备 | 第61-62页 |
| 2.3.14 MilA及其突变体蛋白的体外反应体系及检测方法 | 第62页 |
| 2.3.15 MilB及其突变体蛋白的体外反应及检测方法 | 第62-63页 |
| 2.3.16 生物信息学分析 | 第63-65页 |
| 第三章 胞苷酸羟甲基化酶MilA的结构和功能研究 | 第65-101页 |
| 3.1 研究背景及前期工作简介 | 第65-68页 |
| 3.1.1 胞苷酸羟甲基化酶MilA及其核糖底物特异性 | 第65-68页 |
| 3.2 MilA蛋白的晶体结构解析 | 第68-80页 |
| 3.2.1 MilA蛋白的表达和纯化 | 第68-70页 |
| 3.2.2 MilA晶体生长和数据收集 | 第70-74页 |
| 3.2.3 MilA晶体重原子衍生物的制备以及硒代蛋白的表达、纯化、结晶和数据收集 | 第74-77页 |
| 3.2.4 结构解析和数据修正 | 第77-78页 |
| 3.2.5 MilA分别与CMP/dCMP/hmCMP的共结晶以及结构解析 | 第78-80页 |
| 3.3 MilA及MilA与底物复合物的整体结构 | 第80-84页 |
| 3.3.1 MilA及MilA与底物复合物的整体结构 | 第80-82页 |
| 3.3.2 MilA与CH和TS结构的比较 | 第82-84页 |
| 3.4 MilA、 CH和TS不同的底物特异性和催化特异性的结构基础 | 第84-97页 |
| 3.4.1 MilA的核糖底物识别特异性 | 第85-91页 |
| 3.4.2 MilA及其突变体的体外反应验证影响核糖底物识别特异性的氨基酸 | 第91-93页 |
| 3.4.3 MilA、CH和TS碱基识别特异性 | 第93-94页 |
| 3.4.4 MilA/CH催化的羟甲基反应和TS催化的甲基化反应 | 第94-97页 |
| 3.5 MilA与其同源蛋白的序列比对分析 | 第97-101页 |
| 第四章 羟甲基胞苷酸N-糖苷酶MilB的结构和功能研究 | 第101-132页 |
| 4.1 研究背景及前期工作简介 | 第101-103页 |
| 4.1.1 N-糖苷酶MilB对核糖底物/脱氧核糖底物的偏好性 | 第101页 |
| 4.1.2 N-糖苷酶MilB的天然底物是hmCMP | 第101-103页 |
| 4.2 实验结果与讨论 | 第103-129页 |
| 4.2.1 MilB蛋白的表达和纯化 | 第103-104页 |
| 4.2.2 MilB晶体生长和数据收集 | 第104-105页 |
| 4.2.3 硒代甲硫氨酸MilB蛋白的表达、纯化、结晶和数据收集 | 第105-106页 |
| 4.2.4 MilB及MilB E103A_hmCMP复合物的晶体结构解析和表征 | 第106-109页 |
| 4.2.5 MilB的二聚体结构及其与NDT蛋白家族的结构比较 | 第109-111页 |
| 4.2.6 MilB核糖底物/脱氧核糖底物的偏好性的结构基础 | 第111-115页 |
| 4.2.7 MilB,MilB E103A_hmCMP与MilB_CMP的晶体结构比较 | 第115-116页 |
| 4.2.8 MilB的活性位点中负责hmCMP识别的关键氨基酸 | 第116-117页 |
| 4.2.9 Arg23在hmCMP识别过程中的构象变化及作用 | 第117-119页 |
| 4.2.10 MilB与其同源蛋白的序列比对分析 | 第119-123页 |
| 4.2.11 野生型MilB及其Arg23不同的突变体蛋白对hmCMP和CMP的水解活性 | 第123-129页 |
| 4.3 本章小结 | 第129-132页 |
| 第五章 总结与展望 | 第132-135页 |
| 5.1 本研究工作总结 | 第132-133页 |
| 5.2 本研究主要创新点 | 第133页 |
| 5.3 进一步工作和展望 | 第133-135页 |
| 5.3.1 MilA催化底物CMP加载羟甲基的机制 | 第133-134页 |
| 5.3.2 利用酶工程技术和基因工程技术改造米多霉素的生物合成 | 第134-135页 |
| 参考文献 | 第135-140页 |
| 致谢 | 第140-143页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第143页 |
