| 摘要 | 第5-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 缩略词表 | 第19-21页 |
| 第一章 前言 | 第21-31页 |
| 1.1 结直肠癌治疗的研究现状 | 第21-22页 |
| 1.1.1 结直肠癌发病率 | 第21页 |
| 1.1.2 结直肠癌的治疗方法 | 第21-22页 |
| 1.2 ras基因 | 第22-24页 |
| 1.2.0 ras基因介绍 | 第22-23页 |
| 1.2.1 ras基因的致癌机理 | 第23-24页 |
| 1.2.2 ras相关肿瘤的治疗研究 | 第24页 |
| 1.3 腺病毒载体改造研究 | 第24-27页 |
| 1.3.1 腺病毒介绍 | 第24-26页 |
| 1.3.2 腺病毒载体改造的研究现状 | 第26-27页 |
| 1.4 CIK细胞 | 第27-29页 |
| 1.4.1 CIK细胞介绍 | 第27页 |
| 1.4.2 CIK细胞的作用机制 | 第27-28页 |
| 1.4.3 CIK细胞作为细胞载体的研究现状 | 第28-29页 |
| 1.5 本课题研究意义 | 第29-31页 |
| 第二章 重组腺病毒KGHV500的包装、扩增和纯化 | 第31-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-32页 |
| 2.1.1 细胞株 | 第31页 |
| 2.1.2 质粒 | 第31页 |
| 2.1.3 细胞培养相关试剂 | 第31页 |
| 2.1.4 细菌培养相关试剂 | 第31页 |
| 2.1.5 病毒纯化主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.6 主要仪器设备 | 第32页 |
| 2.1.7 引物合成 | 第32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.2.1 HEK293细胞培养 | 第32-35页 |
| 2.2.1.1 细胞复苏 | 第32-33页 |
| 2.2.1.2 细胞传代 | 第33-34页 |
| 2.2.1.3 细胞计数 | 第34页 |
| 2.2.1.4 细胞冻存 | 第34-35页 |
| 2.2.2 穿梭质粒pXC1-hTERT-scFv-HRE及骨架质粒pBHGE3-F35的提取 | 第35-38页 |
| 2.2.2.1 含pXC1-hTERT-ScFv-HRE和pBHGE3-F5/35的单克隆菌液培养 | 第35页 |
| 2.2.2.2 pXC1-hTERT-ScFv-HRE和pBHGE3-F5/35质粒提取 | 第35-37页 |
| 2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒大小 | 第37页 |
| 2.2.2.4 PCR反应鉴定目的片段 | 第37-38页 |
| 2.2.3 重组腺病毒KGHV500包装 | 第38-39页 |
| 2.2.4 KGHV400和KGHV500病毒的扩增 | 第39页 |
| 2.2.5 KGHV400和KGHV500病毒纯化 | 第39-42页 |
| 2.2.5.1 不连续密度梯度离心 | 第39-40页 |
| 2.2.5.2 连续密度梯度离心 | 第40页 |
| 2.2.5.3 透析袋的活化、病毒溶液去盐和浓缩 | 第40-42页 |
| 2.2.6 TCID50法测定重组腺病毒滴度 | 第42-43页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第43-48页 |
| 2.3.1 HEK293细胞培养 | 第43页 |
| 2.3.2 含pXC1-hTERT-ScFv-HRE和pBHGE3-F5/35的单克隆菌液培养 | 第43-44页 |
| 2.3.3 含pXC1-hTERT-ScFv-HRE和pBHGE3-F5/35的质粒提取和鉴定 | 第44-45页 |
| 2.3.4 PCR目的片段的鉴定 | 第45页 |
| 2.3.5 重组腺病毒KGHV500包装 | 第45-46页 |
| 2.3.6 重组腺病毒KGHV500的扩增 | 第46页 |
| 2.3.7 重组腺病毒的纯化 | 第46-47页 |
| 2.3.8 重组腺病毒的滴度测定 | 第47-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-50页 |
| 第三章 KGHV500的体外实验研究 | 第50-67页 |
| 3.1 材料 | 第50页 |
| 3.1.1 细胞株 | 第50页 |
| 3.1.2 CIK细胞培养相关试剂 | 第50页 |
| 3.1.3 体外实验相关试剂 | 第50页 |
| 3.1.4 主要仪器设备 | 第50页 |
| 3.2 实验方法 | 第50-57页 |
| 3.2.1 细胞蜡块制作 | 第50-51页 |
| 3.2.2 常规HE染色 | 第51-52页 |
| 3.2.3 免疫组织化学染色法 | 第52-53页 |
| 3.2.4 KGHV500感染SW480细胞的电镜观察 | 第53-54页 |
| 3.2.5 KGHV500感染SW480细胞最佳MOI值确定 | 第54页 |
| 3.2.6 细胞划痕实验检测KGHV500对SW480细胞的迁移能力的影响 | 第54页 |
| 3.2.7 侵袭小室实验检测KGHV500对SW480细胞的侵袭能力的影响。 | 第54-55页 |
| 3.2.8 MTT检测KGHV500对SW480细胞的杀伤能力 | 第55页 |
| 3.2.9 TUNEL检测细胞凋亡 | 第55-56页 |
| 3.2.10 CIK细胞的分离制备 | 第56-57页 |
| 3.2.11 CIK细胞装载重组腺病毒 | 第57页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第57-65页 |
| 3.3.1 肿瘤细胞表面CD46鉴定 | 第57-58页 |
| 3.3.2 KGHV500感染SW480细胞的电镜观察 | 第58页 |
| 3.3.3 KGHV500感染SW480细胞最佳MOI值确定 | 第58-59页 |
| 3.3.4 细胞划痕实验检测感染KGHV500对SW480细胞的迁移能力的影响 | 第59-60页 |
| 3.3.5 Transwell试验检测感染KGHV500对SW480细胞的侵袭能力 | 第60-61页 |
| 3.3.6 MTT检测病毒KGHV500对SW480细胞的杀伤能力的影响 | 第61-62页 |
| 3.3.7 TUNEL法检测细胞凋亡 | 第62-63页 |
| 3.3.8 CIK细胞培养 | 第63-64页 |
| 3.3.9 CIK细胞表面CD46鉴定 | 第64页 |
| 3.3.10 病毒感染CIK细胞效率测定 | 第64-65页 |
| 3.4 讨论 | 第65-67页 |
| 第四章 KGHV500的体内实验研究 | 第67-86页 |
| 4.1 实验材料 | 第67-69页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第67页 |
| 4.1.2 实验分组 | 第67页 |
| 4.1.3 HE染色及免疫组化相关试剂 | 第67页 |
| 4.1.4 Western Blot相关试剂: | 第67-69页 |
| 4.2 实验方法 | 第69-71页 |
| 4.2.1 结直肠癌裸鼠移植瘤模型建立 | 第69页 |
| 4.2.2 尾静脉注射荷载KGHV500的CIK细胞于结直肠癌移植瘤裸鼠 | 第69页 |
| 4.2.3 蛋白免疫印迹(Western ot)实验 | 第69-71页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第71-84页 |
| 4.3.1 结直肠癌裸鼠移植瘤模型的建立 | 第71-73页 |
| 4.3.2 治疗效果检测 | 第73-76页 |
| 4.3.2.1 肿瘤生长曲线绘制 | 第73-74页 |
| 4.3.2.2 肿瘤组织TUNEL检测结果 | 第74-76页 |
| 4.3.3 治疗安全性检测 | 第76-84页 |
| 4.3.3.1 HE染色观察细胞形态 | 第76-77页 |
| 4.3.3.2 免疫组化检测腺病毒表达 | 第77-82页 |
| 4.3.3.3 免疫组化检测单链抗体的表达 | 第82-84页 |
| 4.3.3.4 Western blot检测单链抗体的表达 | 第84页 |
| 4.4 讨论 | 第84-86页 |
| 第五章 总结与展望 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文 | 第98-99页 |
| 附录B 主要仪器设备 | 第99-100页 |
