| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 前言 | 第15-19页 |
| 1 雷帕霉素和LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡及Bim、Bax、Caspase-9及Caspase-3表达的影响 | 第19-58页 |
| 1.1 实验材料 | 第19-22页 |
| 1.1.1 主要试剂 | 第19-20页 |
| 1.1.2 仪器与设备 | 第20-21页 |
| 1.1.3 主要试剂的配置 | 第21页 |
| 1.1.4 细胞及病毒来源 | 第21-22页 |
| 1.1.5 PCR引物序列及长度 | 第22页 |
| 1.2 实验方法 | 第22-30页 |
| 1.2.1 实验路线图 | 第22页 |
| 1.2.2 细胞复苏及冻存 | 第22-23页 |
| 1.2.3 MTT法检测不同浓度雷帕霉素(Rapamycin,Rap)、LY294002对HeLa细胞增殖的影响 | 第23-24页 |
| 1.2.4 病毒扩增 | 第24页 |
| 1.2.5 CVB3病毒毒力的测定 | 第24-25页 |
| 1.2.6 建立细胞模型 | 第25页 |
| 1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 | 第25页 |
| 1.2.8 细胞中总RNA的提取 | 第25-26页 |
| 1.2.9 RNA鉴定 | 第26-27页 |
| 1.2.10 cDNA的合成 | 第27页 |
| 1.2.11 半定量PCR检测凋亡基因表达 | 第27-28页 |
| 1.2.12 Western Bloting检测蛋白表达 | 第28-30页 |
| 1.2.13 数据处理和统计学分析 | 第30页 |
| 1.3 结果 | 第30-52页 |
| 1.3.1 雷帕霉素、LY294002对HeLa细胞活性的影响 | 第30-32页 |
| 1.3.2 CVB3在HeLa细胞上扩增并进行病毒滴度测定 | 第32-33页 |
| 1.3.3 流式细胞仪检测雷帕霉素、LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡的影响 | 第33-35页 |
| 1.3.4 雷帕霉素、LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡过程中病毒复制的影响 | 第35-38页 |
| 1.3.5 雷帕霉素、LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡过程Bim表达的影响 | 第38-41页 |
| 1.3.6 雷帕霉素、LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡过程Bax表达的影响 | 第41-44页 |
| 1.3.7 雷帕霉素、LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡过程Caspase-9表达的影响 | 第44-48页 |
| 1.3.8 雷帕霉素、LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡过程Caspase-3表达的影响 | 第48-52页 |
| 1.4 讨论 | 第52-58页 |
| 1.4.1 雷帕霉素、LY294002均可抑制HeLa细胞活性,并呈浓度依赖效应 | 第53-54页 |
| 1.4.2 雷帕霉素、LY294002对CVB3复制的作用不同但均可促进CVB3诱导的细胞凋亡 | 第54-55页 |
| 1.4.3 雷帕霉素和LY294002可阻断CVB3对Bim活性的抑制作用,进一步促进CVB3诱导的Bax活化 | 第55-56页 |
| 1.4.4 雷帕霉素和LY294002促进CVB3诱导的Caspase-9活化,同时促进Caspase-3的自我裂解,以启动Caspase级联反应 | 第56-58页 |
| 2 构建人4EBP1、p70S6K、Akt1和Akt2稳定过表达的HeLa细胞株 | 第58-85页 |
| 2.1 实验材料与方法 | 第58-60页 |
| 2.1.1 主要试剂 | 第58-59页 |
| 2.1.2 仪器与设备 | 第59页 |
| 2.1.3 主要试剂的配置 | 第59-60页 |
| 2.1.4 细胞及表达载体来源 | 第60页 |
| 2.1.5 PCR引物序列及长度 | 第60页 |
| 2.2 实验方法 | 第60-68页 |
| 2.2.1 HeLa细胞培养 | 第60页 |
| 2.2.2 RT-PCR分别扩增4EBP1、p70S6K及Akt1开放阅读框 | 第60-64页 |
| 2.2.3 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第64-67页 |
| 2.2.4 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-P70S6K稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第67页 |
| 2.2.5 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-Akt1稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第67-68页 |
| 2.2.6 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-Akt2稳定表达细胞株的构建与鉴定 | 第68页 |
| 2.2.7 数据处理和统计学分析 | 第68页 |
| 2.3 结果 | 第68-84页 |
| 2.3.1 RT-PCR分别扩增4EBP1、p70S6K及Akt1开放阅读框产物验证 | 第68-69页 |
| 2.3.2 pcDNA3.1-myc-HisA(-)稳定表达细胞株的建立与鉴定 | 第69-70页 |
| 2.3.3 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第70-72页 |
| 2.3.4 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-p70S6K稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第72-76页 |
| 2.3.5 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-Akt1稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第76-80页 |
| 2.3.6 pcDNA3.1-myc-HisA(-)-Akt2稳定过表达细胞株的构建与鉴定 | 第80-84页 |
| 2.4 讨论 | 第84-85页 |
| 3 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡及对Bim、Bax、Caspase-9及Caspase-3表达的影响 | 第85-124页 |
| 3.1 实验材料与方法 | 第85-86页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第85-86页 |
| 3.1.2 仪器与设备 | 第86页 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 | 第86页 |
| 3.1.4 细胞及病毒来源 | 第86页 |
| 3.1.5 Real-time荧光定量PCR(RTFQ PCR)引物序列 | 第86页 |
| 3.2 实验方法 | 第86-90页 |
| 3.2.1 实验路线图 | 第87页 |
| 3.2.2 细胞复苏、冻存及传代培养 | 第87页 |
| 3.2.3 病毒扩增及滴度测定 | 第87页 |
| 3.2.4 建立CVB3感染细胞模型 | 第87页 |
| 3.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 | 第87-88页 |
| 3.2.6 DAPI染色观察CVB3感染后细胞核形态的改变 | 第88页 |
| 3.2.7 细胞中总RNA的提取及鉴定 | 第88页 |
| 3.2.8 cDNA的合成 | 第88页 |
| 3.2.9 RTFQ PCR检测凋亡基因表达 | 第88页 |
| 3.2.10 Western Bloting检测蛋白表达 | 第88-89页 |
| 3.2.11 免疫荧光法检测VP1蛋白表达 | 第89页 |
| 3.2.12 电镜观察CVB3复制 | 第89-90页 |
| 3.2.13 数据处理和统计学分析 | 第90页 |
| 3.3 结果 | 第90-117页 |
| 3.3.1 CVB3在HeLa细胞上扩增并进行病毒滴度测定 | 第90-91页 |
| 3.3.2 流式细胞仪检测过表达4EBP1、p70S6Kv Aktl或Akt2对CVB3诱导的HeLa细胞调亡的影响 | 第91-93页 |
| 3.3.3 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3诱导的HeLa细胞凋亡过程中细胞形态的变化 | 第93-95页 |
| 3.3.4 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3感染HeLa细胞后病毒复制的影响 | 第95-101页 |
| 3.3.5 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3感染HeLa细胞后Bim表达的影响 | 第101-105页 |
| 3.3.6 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3感染HeLa细胞后Bax表达的影响 | 第105-108页 |
| 3.3.7 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3感染HeLa细胞后Caspase-9表达的影响 | 第108-112页 |
| 3.3.8 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2对CVB3感染HeLa细胞后Caspase-3表达的影响 | 第112-117页 |
| 3.4 讨论 | 第117-124页 |
| 3.4.1 过表达4EBP1、p70S6K、Akt1或Akt2可促进CVB3诱导的细胞凋亡和细胞病变效应 | 第118-119页 |
| 3.4.2 过表达p70S6K、Akt1或Akt2可促进CVB3 mRNA合成而抑制VP1表达,过表达4EBP1则抑制CVB3 mRNA合成而促进VP1表达 | 第119-121页 |
| 3.4.3 CVB3诱导的Bim和Bax的表达可被过表达4EBP1、p70S6K抑制,同时可被过表达Akt进一步活化 | 第121-122页 |
| 3.4.4 CVB3诱导的Procaspase-9、Caspase-3自我裂解可被过表达4EBP1、p70S6K激活,同时被过表达Akt1、Akt2阻断 | 第122-124页 |
| 4 结论 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-135页 |
| 综述 | 第135-148页 |
| 参考文献 | 第142-148页 |
| 在读期间主要研究成果 | 第148-150页 |
| 致谢 | 第150页 |
