摘要 | 第4-7页 |
Abstract | 第7-11页 |
英文缩略词表 | 第12-17页 |
第一章 前言 | 第17-31页 |
1.1 家族型淀粉样多神经病 | 第17页 |
1.2 TTR 基因点突变是导致 FAP 的主要原因 | 第17-21页 |
1.3 基因突变导致 TTR 蛋白稳定性下降形成低聚物和淀粉样纤维 | 第21-24页 |
1.4 TTR 蛋白低聚物和淀粉样沉积引发细胞毒性 | 第24-26页 |
1.5 FAP 疾病的治疗 | 第26页 |
1.6 论文设计依据和研究思路 | 第26-30页 |
1.7 技术路线 | 第30-31页 |
第二章 转甲状腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突变体的体外表达与纯化 | 第31-55页 |
2.1 实验材料和仪器 | 第33-40页 |
2.1.1 材料 | 第33页 |
2.1.2 试剂 | 第33-34页 |
2.1.3 溶液配制 | 第34-39页 |
2.1.4 仪器 | 第39-40页 |
2.2 实验方法 | 第40-50页 |
2.2.1 TTR 基因的合成 | 第40页 |
2.2.2 pQE30-野生型 TTR 质粒构建 | 第40-43页 |
2.2.3 pQE30-TTR V30M 和 pQE30-TTR V30A 质粒构建 | 第43-46页 |
2.2.4 转化 pQE30-TTRs 质粒到 M15[pREP4]菌中 | 第46页 |
2.2.5 TTRs 蛋白的表达 | 第46-48页 |
2.2.6 TTRs 蛋白的 Ni 柱纯化 | 第48-49页 |
2.2.7 TTRs 蛋白的透析和冻干 | 第49-50页 |
2.3 实验结果 | 第50-53页 |
2.3.1 PGE-TTR 和 pQE30 空载体质粒双酶切 | 第50-51页 |
2.3.2 构建 PGE-TTR V30A 和 PGE-TTR V30M 质粒 | 第51页 |
2.3.3 IPTG 诱导 TTRs 蛋白表达 | 第51-52页 |
2.3.4 TTRs 蛋白的可溶性检测 | 第52-53页 |
2.3.5 TTRs 蛋白的镍柱纯化 | 第53页 |
2.4 讨论 | 第53-54页 |
2.5 小结 | 第54-55页 |
第三章 转甲状腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突变体体外稳定性研究 | 第55-77页 |
3.1 实验材料和仪器 | 第56-57页 |
3.1.1 实验材料 | 第56页 |
3.1.2 试剂 | 第56页 |
3.1.3 溶液配制 | 第56-57页 |
3.1.4 仪器 | 第57页 |
3.2 实验方法 | 第57-61页 |
3.2.1 OD400nm 光密度分析 | 第57-58页 |
3.2.2 ThT 荧光检测法 | 第58页 |
3.2.4 等温微量热滴定法 | 第58页 |
3.2.5 SDS-PAGE 电泳 | 第58-59页 |
3.2.6 白藜芦醇结合分析 | 第59页 |
3.2.7 色氨酸荧光检测 | 第59-60页 |
3.2.8 圆二色谱法 | 第60页 |
3.2.9 分子动力学模拟 | 第60-61页 |
3.2.10 统计学分析 | 第61页 |
3.3 实验结果 | 第61-74页 |
3.3.1 V30A 突变对 TTR 淀粉样纤维形成的影响 | 第61-64页 |
3.3.2 T_4和 Flu 对 TTR 野生型和 V30A、V30M 突变体形成淀粉样沉淀的影响 | 第64-66页 |
3.3.3 用等温微量热滴定法检测 Flu 与 TTRs 的结合力 | 第66-67页 |
3.3.4 V30A 突变对 TTR 四级结构稳定性的影响 | 第67-70页 |
3.3.5 V30A 突变对 TTR 三级结构稳定性的影响 | 第70-71页 |
3.3.6 V30A 突变对 TTR 二级结构稳定性的影响 | 第71-73页 |
3.3.7 TTR 野生型和 V30A,V30M 突变体的分子动力学模拟 | 第73-74页 |
3.4 讨论 | 第74-76页 |
3.5 小结 | 第76页 |
3.6 工作展望 | 第76-77页 |
第四章 转甲状腺素蛋白野生型、V30A、V30M 突变体的细胞毒作用及其作用机制 | 第77-97页 |
4.1 实验材料和仪器 | 第78-82页 |
4.1.1 实验材料 | 第78页 |
4.1.2 试剂 | 第78-79页 |
4.1.3 溶液配制 | 第79-81页 |
4.1.4 仪器 | 第81-82页 |
4.2 实验方法 | 第82-85页 |
4.2.1 IMR-32 细胞培养 | 第82页 |
4.2.2 MTT 法 | 第82页 |
4.2.3 台盼蓝染色法 | 第82页 |
4.2.4 活性氧水平检测 | 第82-83页 |
4.2.5 免疫蛋白印迹 | 第83-84页 |
4.2.6 透射电镜 | 第84页 |
4.2.7 统计学分析 | 第84-85页 |
4.3 实验结果 | 第85-94页 |
4.3.1 TTRs 蛋白致 IMR-32 细胞毒性 | 第85-87页 |
4.3.2 TTRs 蛋白对细胞内活性氧水平的影响 | 第87-88页 |
4.3.3 TTRs 对细胞内 DNA 损伤蛋白表达水平的影响 | 第88-89页 |
4.3.4 TTRs 对细胞内凋亡相关蛋白的影响 | 第89-91页 |
4.3.5 TTRs 对细胞内自噬相关蛋白的影响 | 第91-92页 |
4.3.6 TTRs 对热休克蛋白 HSP70 的影响 | 第92-93页 |
4.3.7 V30A 突变体透射电镜形态观察 | 第93-94页 |
4.4 讨论 | 第94-95页 |
4.5 小结 | 第95-96页 |
4.6 工作展望 | 第96-97页 |
结论 | 第97-99页 |
参考文献 | 第99-114页 |
攻读博士学位期间发表的文章及参加学术活动 | 第114-115页 |
致谢 | 第115-116页 |